1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然色素生产菌的诱变选育 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 在已诱变过的原始菌株中筛选出红色素高产菌株，并将其作为出发菌株，采用微波 氯化锂复合诱变方法。结果通过微波 氯化锂 复合处理获得一株高产菌株色素产量比原始菌株提高了 5%，但经 4次传代实验证明，突变高产菌株不具备遗传稳定的性质。 关键词 ： 红色素；氯化锂；诱变；微波 II Abstract: The starting strain with high-yield natural red pigment was separated
2、 from a mutant strain which was partly degenerated. In this experiment get a higher-yield natural red pigment through the composite mutation with microwave processing and licl. A high-yield mutant strain was obtained by composite mutation with microwave processing and licl. The high-yield stain had
3、genetic Stability by three times genetic trials, and the yield of red pigment was improved 5% than the control.But it hasnt the nature of the genetic stability. Keywords: red pigment;licl;mutation; microwave目 录 1 绪论 . 1 1.1 选题的背景和意义 . 1 1.2.诱变选育技术获得高产色素生产菌株 . 2 1.2.1 诱变选育定义 . 2 1.2.2 诱变剂的种类和选择 . 2 1
4、.2.3 诱变处理 . 3 1.3 诱变实例借鉴 . 5 1.4 诱变育种新技术 . 6 1.4.1 离子注入诱变技术 . 6 1.4.2 激光诱变育种 . 6 1.4.3 空间诱变 . 6 1.4.4 其他新型诱变技术 . 6 1.5 相关研究的最新成果及动态 . 7 1.6 实验的目的、内容与难点 . 7 2 实验部分 . 8 2.1 实验材料 . 8 2.1.1 菌种 . 8 2.1.2 主要仪器与试剂 . 8 2.1.3 培养基 . 8 2.2 实验方法 . 9 2.2.1 菌种的培养与活化 . 9 2.2.2 菌种的保藏 . 9 2.2.3 菌种的纯化 . 9 2.2.4 优良出发菌
5、株的筛选 . 9 2.2.5 微波氯化锂复合诱变 . 9 2.2.6 致死率的确定 . 9 2.2.7 初筛 . 10 2.2.8 摇瓶培养及 色素量的测定 . 10 2.2.9 复筛 . 10 2.2.10 稳定性的确定 . 10 2.2.11 灵菌红素吸光度标准曲线测定 . 10 3 结果与分析 . 11 3.1 优良出发菌株的筛选 . 11 3.1.1 标准曲线的测定 . 11 3.1.2 单个平板菌株的初筛 . 11 3.1.3 平板菌株的复筛 . 12 3.1.4 优良菌株的稳定性 . 12 3.2 致死率与诱变剂量的关系 . 13 3.2.1 微波诱变机理 . 13 3.2.2 照
6、射时间和致死率关系 . 13 3.2.3 致死率曲线 . 13 3.3 高产菌株的初筛 . 14 3.3.1 初筛 . 14 3.3.2 一次复筛 . 15 3.3.3 二次复筛 . 16 3.4 高产株与对照株比较 . 16 3.5 突变菌株的稳定性实验 . 17 4 结论 . 18 参考文献 . 19 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题的背景和意义 红色素分为人工合成色素和天然色素两大类，由于合成 色素的安全性问题，不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限制，尤其在食品、医药、和化妆品行业。随着 人们逐渐认识到许多人工合成色素对人体极端有害 且 人工合成红色素对人
7、体健康的危害越来越多地被发现，尤其是致癌、致畸、致突变、致敏已引起人们的高度重视 1。因此，利用无毒害并有一定药理作用的天然植物提取食和色素，这是当今的新趋势。 天然色素与人工合成色素相比有无毒、安全性高，色泽自然鲜艳、并有很高的营养价值和药理功能等优越性，日益受到重视和青睐。开发天然色素是世界应用色素发展的总趋势，很多天然色素具有安全可靠，没有 毒副作用，色调自然，接近天然物质等优点，天然、营养、多功能是色素发展的趋势。天然色素现在主要三从植物、动物材料和微生物细胞中获得。因动植材料生长繁殖受季节、气候、产地等因素的影响，原料不足，从中提取的色素价格昂贵，应用受到局限，而利用微生物资源生产天
8、然色素，克服以动植物为原料生产天然色素的诸多缺点，并且易于工业化。因此，采用微生物生产天然色素将逐步成为天然色素来源的主流 2 。 利用微生物资源，通过对环境友好的生物法生产天然色素，不仅能克服以植物为原料生产天然色素，周期长、提取复杂、原料不足、价格昂贵等 诸多缺点，且易满足规范化、标隹化、连续化的工业化大生产需要。因此，采用微生物生产天然色素将会成为天然色素来源主要途径。现在人类对于色素的需求不断的增加，而化学合成色素远远无法满足人们的需求，同时化学合成存在着种种问题，人们不断的去追求新的方法，而从植物中提取也存在很多的问题，人们把目标转移到了微生物中发酵产生人们所需的天然红色素来满足自己
9、的需求。同时微生物具备较好的优点，解决化学合成和动植物中提取的缺陷。随着工业的发展，提取的方法不断的改善，人们还是不满足现在的现状，微生物的产色素的量还是不够，提取的完善， 现阶段通过改变微生物产红色素的能力，提高产量来满足色素的供应。微生物产红色素还不时很完美，同样需要不断的改进 3。 这次实验研究的对象是灵菌红素。 灵菌红素族 (Prodigiosins,PG)是一个天然红色素家族的总称 ， 包括 Prodigiosin , Prodi2giosin 25-C， Metacycloprodigiosin,Uncedylprodigiosin 等 ， 可以由多种放线菌和细菌产生。这一族色素通
10、常都具有甲氧基吡咯的骨架结构，具有一定的免疫抑制性质。近年，研究人员的注意力都集中在由沙雷氏菌产生 的灵菌红素潜在的临床应用上面。灵菌红素(Prodigiosin)是一种很有潜力的抗肿瘤药物 ， 灵菌红素对人结肠腺癌细胞 DLD-1 与 SW-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 的实验均证实其对这些肿瘤细胞有诱导凋亡作用。美国国立癌症研究所 (NSI) 2 证实灵菌红素在平均 IC50 为 2.1 mol/L 时对 57 种不同的人癌细胞有抗性作用 ， 在相同的作用剂量下 ， 对正常细胞无任何毒害作用。 20 世纪 60 年代早期， Rapoport 等首先描述了 PG 化学合成的全过程，但比
11、较复杂和困难。 1996年 DAlessio 等 4提出了新的 制备 PG 类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和 A 环结合（以往模拟生物合成路线是先将 B 环和 A 环相连）即得 PG 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能用来合成天然的十二烷基 PG。 Dairi 等 5利用市售商品 4-methoxy-3-Pyrrotin-2-one 经两步反应得到了 PG 前体物质 4-methoxy-2,2-bipyrrole-5-carboxatdehyde,然后将不同的吡咯及其派生物与其相连接得到了不同的 PG 类似物。 利用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于
12、微生物发酵生产。国内外对 产 PG微生物的研究主要集中在陆地微生物沙雷菌上。故非常有必要运用诱变育种技术筛选出高产灵菌红素的菌株。 1.2.诱变选育技术获得高产色素生产菌株 1.2.1 诱变选育定义 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 1.2.2 诱变剂的种类和选择 A.诱变剂种类的选择 物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦耳）
13、、 X 射线（库仑 /千克）、射线、射线、射线和超声波等；化学诱变剂包括 甲基磺酸乙酯（ EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型 ，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处3 理，从中筛选突变体。并结合自然分离和环境条件的改
14、变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。 B、最适诱变剂量的选择 诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大比例，这样可减少以后的筛选工作。 要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高 剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、 x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中
15、，目前较倾向于采用较低剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为 90 99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为 70% 75%，甚至更低 (30%70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此 6。 化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、 pH 等）。物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等），以达到最佳的诱变效果。 1.2.3 诱变处理 A、 不同诱变处理方法 （ 1）紫外线照射 紫外线诱变育种的原理是：紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为 136 300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，
16、多种微生物最敏感的波长集中在 265nm 处，对应于功率为 15W 的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线 的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA 分子结构变化而造成的。这种变化包括 DNA 链的断裂， DNA 分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于 DNA 的变化起主要作用。 不同的微生物对于紫外线的敏感
17、程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不4 同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。 一般以照射后微生物的致死率在 90%99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率 70%75%甚至更低 (30%70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。 （ 2） 等离子输入 等离子输入是一种较
18、新的诱变方法，国外自 20 世纪 60 年代中、后期相继开始把 等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于 1986 年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与 射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键 或缺陷；同时还有质
19、量沉积，离子束是高 LET 粒子，有 Braag 峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。 （ 3） CO60 照射 CO60 属 射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而 与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变 DNA 结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧
20、核糖的化学键、糖 -磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于 DNA 分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对 C060 的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。 5 一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在 410 万伦琴，或者采用能使微生物产 生 90 99死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。 B、不同诱变处理方式 单一因子处理：采
21、用单一诱变剂处理，可以减少减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。 复合因子处理：指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。主要有：两个以上因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一种诱变剂连续重复使用；紫外线复活交替处理。 1.3 诱变实例借鉴 目 前诱变选育运用较多的还是紫外线诱变由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。 孙文红 ,高玉荣在紫外诱变选育红曲红色素高产菌株的研究中运用了紫外线照射并确定了合适的诱变剂量： 2.5min 为最佳
22、诱变时间。 7 王伟平 ,吴思方等在利用复合诱变红曲霉选育红色素高产菌株中同样采用了紫外线 氯化锂复合诱变技 8这种方式为上诉提到的复合因子处理，是一种比较流行新兴的诱变。 我国学者陶金莉等在选育高产灵菌红素沙雷氏菌株是运用的是紫外线 氯化锂复合诱变技 术确定的紫外照射时间为 20s。实验中在该照射时间下，添加氯化锂发现对致死率没有多大影响，但是正突变率有所提高 9-11。 还有利用微波法选育红曲霉菌种的，左秀凤等人用 50W 的微波照射获得高产菌株，研究了微波照射时间与正突变率，死亡率的关系，从而确定了适合的诱变剂量。 12 此外有运用离子注入的方法来获得诱变菌株：孙洁 ; 吕加平 等人利用 N+注入诱变高自溶度的乳酸菌突变株 ，诱变的效果也是非常好的。 诱变选育的例子举不胜举，但是从这些例子当中可以总结出诱变选育的基本流程步骤和一些方法。
