1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 多酚氧化酶活性测定及控制 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 ： 研究抑制多酚氧化酶 (PPO)活性的方法，为莲藕保鲜过程中控制褐变提供理论依据。试验研究了温度、 pH 值、底 物浓度以及抑制剂对莲藕多酚氧化酶 (PPO)的影响。结果表明：莲藕 PPO 最适 pH 值为 7.5，最适温度为 35。亚硫酸钠、抗坏血酸 (Vc)对莲藕 PPO 活性具有较好抑制作用，柠檬酸、半胱氨酸也对莲藕 PPO 活性具有一定抑制作用。可以通过浸泡亚硫酸钠和抗坏血酸 (Vc)、调节 pH 值、低温贮藏等方法来抑制莲
2、藕 PPO 活性，控制莲藕褐变。 关键词 ：多酚氧化酶；活性测定；抑制剂 II Activity Determining and Inhibiting Polyphenol Oxidase Abstract： Objective The research ami ed to study the enzymatic characteristics ofPPO in lotus sprou.t Method The effects of temperature, pH value and inhibitorsonPPO activity of lotus sproutwere studied us
3、ing spectrophotometrymethod, catecholas substrate, and the reaction kinetic equationwas established. Result The results showed that the optmi um temperature and pH were 30 and 6. 0 respectively. PPOwas inactivitywhen keeping heat in 70 by 60min. Ascorbic acid, citric acid,L-cysteine and stannous chl
4、oride could all inhibitPPO activity, and the strongest inhibitors of the activitywereL-cysteine, stannous chloride, followed by citric acid, ascorbic acid, 0. 20 g/LL-cysteine, stannous chloride could inhibit PPO activity effectively. ConclusionThe study can provide reference for reasonably utilizin
5、g the lotus sprout resources and the scientific control of its enzymatic browning during deep processing. Key words： PPO； Inhibitor； Activity detection 目 录 1 绪论 . 1 1.1选题背景及意义 . 1 1.2 最新研究成果及动态 . 1 1.2.1 鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化 . 1 1.2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较 . 1 1.2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系 . 2 1.2.4 核桃组织培养中外植体
6、褐变多酚氧化酶活性的控 制 . 2 1.2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶 (PPO)活性测定的最佳试验条件 . 2 1.2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶 (PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化 . 2 1.2.7 磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响 . 2 1.2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响 . 3 1.2.9 二氧化氯 (ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶 (PPO)的影响 . 3 1.2.10 底物浓度、 pH、温度对鲜切莲藕中 PPO酶的影响 . 3 1.2.11 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 . 3 1.2.12 护色处理对多酚氧化酶活性的 影
7、响 . 3 1.2.13 气调包装对鲜切莲藕的保鲜效果 . 4 2.1 主要试剂及设备 . 5 2.1.1 实验材料 . 5 2.1.2 主要试剂与仪器 . 5 2.2 实验流程 . 6 2.3 分析方法 . 6 2.3.1 粗酶液的制备 . 6 2.3.2 PPO活性的测定 . 7 2.3.3 温度对多酚氧化酶活性的影响 . 7 2.3.4 pH对多酚氧化酶活性的影响 . 7 2.3.5 底物浓度对 PPO活性的影响 . 7 2.3.6 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 . 7 2.3.7 用抑制剂对自制的粗酶液进行活性测定分析 . 8 3 结果与分析 . 9 3.1 温度对 PPO活性的影响
8、. 9 3.2 pH 对 PPO活性的影响 . 10 3.3 底物浓度对 PPO活性的影响 . 10 3.4 抑制剂对 PPO活性的影响 . 12 3.4.1 L-半胱氨酸 对 25KU多酚氧化酶活性的影响 . 12 3.4.2 单抑制剂对 PPO活性的影响 . 13 4 结论 . 15 参考文献 . 16 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题背景及意义 多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase， PPO)是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的含铜末端氧化酶 (Mayer 1987； Mayer&Harel， 1991)。它包括单酚氧化酶、双酚氧化酶和漆酶。它广
9、泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后， PPO 所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损 失营养。多酚氧化酶（ PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO 与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制 PPO 活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、 pH 值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。 本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 1.2 最新研究成果及动态 1.2.1 鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的
10、分离纯化 从 鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀， DEAE-SepH-Arose 离子交换柱层析以及 PHenyl SepHArose 6FAsT Flow 疏水柱层析进行纯化后，经 SDS-PAGE 电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。在整个过程中，该酶纯化了 95.66 倍，产率为 2.4。同时研究表明，鲜切莲藕组织中 PPO 相对分子质量在 65 900 66 100 之间。 1.2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较 以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测 PPO 活性极显著相关，邻苯二酚所测活性强，但酪氨酸所测活性的 变异系数大。面粉 PPO 活性和面粉及面制品色
11、泽的变化相关性最强 ,但籽粒和全麦粉中的PPO 活性高，变异系数大。 2 1.2.3 PPO 活性与小麦粉主要理化指标的关系 PPO 活性与小麦粉白度成极显著负相关性，与灰分含量成极显著正相关性；前路粉流 PPO 活性比后路粉流低；物料含皮较多的在线粉流 PPO 活性高；物料来源于小麦胚乳外层的粉流 PPO活性高。 1.2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制 在抑制 PPO 活性方面 ,PVPP 作用最明显 ,其次是 Na2S2O3、 AgNO3。 1.2.5 石榴果皮中的多酚 氧化酶 (PPO)活性测定的最佳试验条件 以邻苯二酚为底物时，底物浓度宜大于 20mmol/L，其最适
12、波长为 420nm，最适 pH 值为 6.8，最适温度为 50，反应时间不宜超过 20min，反应完成后在 20min 后测定 PPO 的活性最为稳定。抑制剂 NaHSO4 的有效抑制浓度为 0.8mmol/L。 1.2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶 (PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化 园二色谱分析表明莲藕 PPO 主要含有一螺旋和一折叠结构。与抑制剂作用后，莲藕 PPO活性显著降低，同时伴随其二级结构中 -螺旋结构明显减少， 表明莲藕 PPO 的活性中心可能位于 -螺旋结构中。荧光分析表明，莲藕 PPO 与邻苯三酚 (pyroGAllic Acid， PA)作用后，酪氨酸残基荧光强
13、度略有降低，入 max位移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低，入 max红移 2 nm；而与莲藕多酚 (LoTus rooT polypHenol， LRP)作用后，莲藕 PPO 分子中酪氨酸 (Tyr)和色氨酸 (Trp)残基荧光强度显著提高，且其最大发射波长分别蓝移 6nm 和红移 5nm。当加入异 Vc 钠后， Tyr 和 Trp残基最大发射峰显著红移，说明 Trp 和防残基位于一定的疏水环境对 维持 PPO 催化活性的优势构象至关重要。 1.2.7 磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响 以邻苯二酚为底物，莲藕 PPO褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学，Km
14、为 0.775mol/L， Vmax 为 11.150U/min。 Vc 对 PPO 有较强的抑制作用，反应动力学参数 Km为 0.081mol/L， Vmax 为 3.243U/min，呈现反竞争性抑制，表现为褐变出现滞后，随 Vc 浓度的增3 大滞后时间逐渐增长，且呈现 S 型趋势，并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下，随着处理时间的变化， PPO 活性呈现 波动性。 3.17A/m 磁场强度下处理 4h 的酶液其反应动力学曲线表现为S 型，并建立了相应的反应方程。 1.2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响 南湖菱 PPO 催化反应的最适温度为 30 0C ，最适 pH 6.
15、5，最佳吸收波长 420 nm ，最大反应速度 Vmax=33.67 uniT/min，米氏常数 Km= 0.286 mol/L。在 3 种抑制剂抗坏血酸、 EDTA 和柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为 0.3 mmol/L。 1.2.9 二氧化氯 (ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶 (PPO)的影响 100mg L 浓度的 ClO2处理鲜切藕片 5min、 10 min、 15 min 后，在贮藏期间能抑制 PPO 的活性，而 10 mg L 浓度对 PPO 的活性不起抑制作用反而促进了 PPO 的活性 100 mg L ClO2 处理鲜切藕片 10 min 抑制 P
16、PO 的活性效果最好。 1.2.10 底物浓度、 pH、温度对鲜切莲藕中 PPO 酶的影响 鲜切莲藕的 PPO 活性最适反应底物浓度为 0.02 mol/L，并且底物浓度与 PPO 活性的关系完全遵循 MicHeAlis-MenTen 的酶促动力学性质。 PPO 最适 pH 值为 7.0， pH 对 PPO 的影响显著，当pH4.0 时， PPO 活性显著下降，可见，调节 pH 值可有效地抑制 PPO 活力。 PPO 活性的最适温度为 35，在 0 -5之间，莲藕的 PPO 活性受到明显的抑制。 1.2.11 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 添加抑制剂可使莲藕 PPO 反应速率发生变化。苯甲酸可
17、与酶 E 结合生成无活性的二元复合物EI，减小可供邻苯二酚进攻的游离酶 E 的浓度，也就降低了酶一底物 ES 的浓度，而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率 ymax，从而破坏了莲藕 PPO 的正常催化氧化反应系统。 1.2.12 护色处理对多酚氧化酶活性的影响 对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为 EDTA 浓度为 0.25% , Vc 浓度为 0.1%、草酸浓度为4 0.25%半胱氨酸浓度为 0.7%、处理时间为 8min。 1.2.13 气调包装对鲜切莲藕的保鲜效果 采用 8 种不同浓度配比的 O2、 N2和 CO2气体对鲜切莲藕进行包装，置于 4下贮藏，定期测定鲜切
18、莲藕 Vc 的含量、多酚氧化酶活性、褐变度以及 pH 值变化，结果显示 100 O2组处理的鲜切莲藕，其外观最好，多酚氧化酶活性受到抑制。 5 2 实验部分 2.1 主要试剂及设备 2.1.1 实验材料 多酚氧化酶冻干粉、新鲜莲藕 2.1.2 主要试剂与仪器 表 2-1 实验试剂 试剂 相对分子量 纯度 邻苯二酚 110.11 CP 聚维酮 / AR. 磷酸二氢钠 138.01 AR. 磷酸氢二钠 141.98 AR Vc 176.13 AR 柠檬酸 210.14 AR 亚硫酸钠 126.04 AR. 硫脲 76.12 AR. L-半胱氨酸 121.16 AR. 表 2-2 实验仪器 所有实验用水均为去离子水。 型号 仪器 厂址 AL-204 电子天平 梅特勒 -托利多仪器上海有限公司 TD5A WS 低速 离心机 长沙湘仪离心机有限公司 SHB-88 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 752S 紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司 DK-524 电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 DS 1 高速 组织 捣碎机 上海标本模型厂制造
