1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 富硒酵母的驯化研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 :硒是人体内必需的微量元素之一，具有诸多的生物学功能，缺硒则会导致多种疾病的发生。硒的补充可以通过摄入无 机硒或有机硒而得以实现。通过酵母在生长过程中对硒的自主吸收和转化，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合，从而消除了无机硒对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。本实验中将酵母接种在添加亚硒酸钠的培养液中进行驯化，获得富集有机硒的酵母用于食品添加。 在单因素实验基础上进行正交试验，获得富硒酵母最大有机硒含量和最
2、大生物量的最佳培养条件。在此条件下，酵母生物量达到 271mg，有机硒含量为 593ug/g，硒有机转化率为 90. 3%。 关键词 :富硒酵母；酵母驯化；发酵；优化 II Abstract： Trace element se is one of the essential element to maintain the bodys normal life activities, ingestion of inorganic-selenium or organic-se can supplement selenium . Yeast independent absorb and transfo
3、rm selenium in the process of cultivation to make selenium and amylase organic combination.That can remove stomach stimulationand and the adverse reaction of inorganic-se to the human for makeing selenium can be more efficient and more secure for the bodys absorption. In this research the yeast was
4、cultured in the culture solution that was added to sodium selenite. The yeast that Se-enriched was used in food add. Based on the results of the sole experiment, the orthogonal experiment for obtaining the largest organic selenium content and the maximum biomass of selenium-rich yeast was designed a
5、nd carried out. In this condition, the maximum biomass can reach 271mg. The content of organic-Se in the yeast can reach 593ug/g, the conversion of organic-Se is 90.3%. Keywords： se-enriched yeast； Yeast domestication； Fermentation; optimization 目 录 摘要 . I 关键词 . I 1 绪论 . 1 1.1 选题意义及背景 . 1 1.2 相关研究的最
6、新成果及动态 . 1 1.3 本文研究内容及目标 . 2 1.3.1 研究内容 . 2 1.3.2 研究目标 . 3 2 实验部分 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.1.1 麦芽及酵母 . 4 2.1.2 主要试剂 . 4 2.1.3 主要仪器 . 5 2.2 实验方法 . 5 2.2.1 麦芽汁培养基制备 . 5 2.2.2 酵母活化及驯化 . 5 2.2.3 酵母培养 . 6 2.2.4 硒含量测定 . 6 3 结果与分析 . 8 3.1 硒含量测定的标准曲线 . 8 3.2 富硒酵母发酵条件优化 . 8 3.2.1 初始硒浓度对酵母培养的影响 . 8 3.2.2 温度对酵母培养的影响
7、 . 9 3.2.3 初始 pH 对酵母培养的影响 . 10 3.2.4 培养时间对酵母培养的影响 . 11 3.2.5 正交试验结构及其数据处理 . 12 3.2.6 硒添加方式的优化 . 14 4 结论 . 16 参考文献 . 17 致谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题意义及背景 硒是人体所必需的微量元素，具有重要的生理功能，它能够预防和抑制肿瘤、抗衰老、维持心血管系统正常的结构与功能，预防动脉硬化和冠心病的出现。 1在我国有近 3/4 的地区缺硒，生物体内的硒都来源于蔬菜、水果等，但这些天然食物中硒含量普遍较低，一般不足 0.01g/g，很难满足中国营养学会 198
8、8 年推 荐的成人硒日摄入量 50g。 2因此在食品中添加硒很有意义，也非常有必要。 研究表明，有机硒在生物体内停留时间较长，在人体硒营养状况良好的情况下，有机硒可贮存起来，当人体硒营养摄入不足时，贮存的有机硒能够补充到生理代谢中，从而满足硒的需求。无机硒 (如亚硒酸盐和硒酸盐 )，进入人体后很快通过排泄途径排出体外，在体内停留时间较短，而且其毒性大于有机硒，而活性又低于有机硒，通常不适合于直接添加到食品中。 3因此通过生物富硒将无机硒转化为有机硒，是生产富硒食品及添加剂的一种安全有效的方法。 1.2 相关研究的最 新成果及动态 自 1973年世界卫生组织确定硒为人体和动物必需微量元素以来，补
9、充硒源多为无机硒。但由于其较高的毒性和较差的使用效果，人们一直在寻找一种更为安全有效的补硒途径。 4 1984年，人工合成的硒蛋氨酸上市。其毒性较低，适宜作为补充硒源。但硒蛋氨酸由于合成工艺复杂和基产出率低等原因， 至今仍未实现工业化生产， 其价格比较昂贵， 限制了其在食品和饲料中的应用。 5 相比而言， 富硒酵母已在许多国家实现了大规模生产， 并已广泛用于人的补硒来源。同时， 富硒酵母也逐渐用于动物营养中。美国 FDA于 2000年 6月首次批准富硒酵母作为有机硒补充物用于家禽饲料。 6对食品安全最为严格的欧盟也于 2006年 9月首次批准富硒酵母作为有机硒补充物用于各种动物。 7 目前，有
10、机硒的获得主要有：微生物转化法、植物天然种子发芽转化法、动物转化法等。其中获得有机硒的主要途径是生物转化。 8由于微生物具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，因此利用微生物进行硒的生物转化不受季节和气候的影响，且生产周期短，容易诱变。而微生物转化法较多的是培养富硒酵母，所用的菌种多为啤酒酵母有机硒可克服无机硒的过氧化作用，其生物活性较 高，能够有效地在机体内同化，有利于在动物体内吸收2 利用。 9酵母菌具有高度的富集硒能力和将无机硒转化为有机硒的能力，单细胞的酵母菌容易诱变，比植物品种容易改良，可采用物理和化学方法诱变育种，从而获得优质的富硒生产菌株。 10因此硒的微生物转化目前也
11、开始成为硒的生物化学研究的重要领域。 目前国内主要研究方向为高富硒酵母的筛选，如：李明春等 11对 5 属 7 种 30 株酵母菌酿酒酵母 22 株，假丝酵母 2 株，裂殖酵母 4 株，汉逊酵母 1 株，球拟酵母 1 株 )进行抗性筛选和摇瓶发酵培养获得 NK2 和 NK4 两株富硒菌株，在 YEPD 培 养基中培养 20h 加硒，培养48h 酵母细胞含硒量达到 800g/g。 范秀英等 12在菌株抗性的研究基础上，采用细胞融合进一步提高了酵母内硒含量。她们通过测定 300 株酵母菌对亚硒酸钠的抗性，从中选出对亚硒酸钠抗性较高的菌株，测定其在含有 150g/ml硒的 YEPD 培养基中培养的细
12、胞生物量和硒含量。从筛选获得的 10 株生物量较高的菌株和 8株硒含量较高的菌株中挑选出一株生物量较高的二倍体 ZY-67和一株硒含量较高的二倍体 ZY-198，按常规方法对其进行生孢培养和单倍体分离，并结合亚硝基胍处理，从突变株中选出带有不 同氨基酸缺陷标记的两个菌株作为融合亲株，在获得的 420 个融合子中选出生物量和硒含量明显优于亲株的遗传稳定的融合菌株 ZFF-28。在实验中，培养基中添加 60g/ml硒，菌株 ZFF-28 的硒含量可达 2000g/g。在优化培养条件下，富硒酵母ZFF-28 生物量可达 8.2g/L，硒含量达 2050g/g。 不仅仅是酿酒酵母，其他一些高营养价值的
13、酵母也被用于富硒研究中。如产朊假丝酵母，其富含必需氨基酸和维生素，蛋白质含量高，并且脂肪含量低。葛晓光等 13在单因素实验的基础上进行正交试验，获得了较优的产朊假丝酵母 生物转化无机硒为有机硒的环境条件组合 :发酵培养基中初始亚硒酸钠浓度 10 mg/L，摇床转速 200 r/min，装液量 40 ml/500 m， l温度 27 ，初始 pH 值 6. 0。在此条件下，酵母生物量达到 11 g/L。 目前关于酵母菌体富集硒元素的研究主要集中在制造方法、应用技术方面，对于富集机理方面也有报道，还存在着许多不足和空白，该方面的相关研究还需加强 ; 富硒酵母的产品中，还含有一定量的无机硒，应通过条
14、件优化，进一步降低其含量，提高有机硒的含量，以更好地指导生产。由于生物机体的复杂性，体内的硒含量和化学形 态的稳定性能难以达到较理想的状态。因此， 在富硒酵母生产研究中，对其相关的应用理论和机理研究应加强投入。14-15 1.3 本文研究内容及目标 1.3.1 研究内容 在初始硒浓度、温度、初始 pH、培养时间等单因素实验基础上，以温度、初始 pH、培3 养时间为主要因素，采用正交试验获得富硒酵母最大硒含量的培养条件，之后通过对硒的添加方式优化，来达到酵母有机硒最大转化率。 1.3.2 研究目标 在获得较高硒含量的富硒酵母前提下，尽量提高酵母有机硒转化率，保证酵母无机硒含量在可摄入安全范围，以
15、用来食品添加。 4 2 实验部分 2.1 实验材料 2.1.1 麦芽及酵母 麦芽经粉碎后备用，鸡蛋取鸡蛋清用于麦芽汁澄清。酵母为实验室酿酒酵母。 2.1.2 主要试剂 试剂名 相对分子质量 水溶性 浓度 规格 来源 硝酸 63.01 易溶 65-68% 分析纯 浙江中星化工有限公司 高氯酸 100.46 极易 70-72% 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 3， 3-二氨基联苯胺(DAB) 396.15 不溶 97.5% 分析纯 上海源叶生物科技有限公司 EDTA二钠盐(C10H14N2Na2O82H2O) 372.24 可溶 99% 分析纯 金砂化工有限公司 硫酸 98.08 易溶 95-9
16、8% 分析纯 衢州巨化试剂有限公司 亚硒酸钠 (Na2SeO3 5H2O) 263.01 可溶 99.0% 分析纯 天津瑞金特化学品有限公司 盐酸 36.46 易溶 36-38% 分析纯 衢州巨化试剂有限公司 氢氧化钠 40 易容 96% 分析纯 浙江中星化工有限公司 甲苯 92.14 极微溶 99.5% 分析纯 杭州化学试剂有限公司 5 2.1.3 主要 仪器 序号 名称 型号 厂家 01 超净工作台 VS-1300 苏州市苏信净化设备厂 02 恒温培养箱 LRH-250A 上海福玛实验设备有限公司 03 全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 YXQ-LS-S 上海博迅实验有限公司医疗设备厂 04
17、紫外可见分光光度计 752S 上海精密仪器仪表公司 05 电子天平 AL204 梅特勒 -托利多仪器有限公司 06 台式高速冷冻离心机 H2050R 长沙湘仪离心机仪器有限公司 07 电热恒温鼓风干燥箱 DGX-9143B-1 上海福玛实验设备有限公司 08 电热恒温水浴锅 DK-S24 上海精宏实验设备有限公司 09 微型植物粉碎机 FZ102 天津市泰斯特仪器有限公司 2.2 实验方法 2.2.1 麦芽汁培养基制备 取一定量的麦芽用粉碎机粉碎，再称取 500g 粉碎后的麦芽 ，加入 2000ml 的水，于 65恒温水浴 4 5 h，搅拌，直至糖化完全（用碘液检验）。经 4 层纱布过滤，再用
18、鸡蛋清沉淀（在 40mL 水中加入 2 个蛋清用玻璃棒搅拌调匀至产生泡沫，倒入糖化液，搅拌煮沸，将滤液静置片刻，过滤）， pH 自然， 在 121 0.1Mpa 下灭菌 30min，备用。 2.2.2 酵母活化及驯化 用接种环将保存在 4 下的酿酒酵母接种于麦芽汁培养基内，在恒温培养箱中 28 下培6 养 2-3 天，酵母长势良好，得到酵母活化种。 将酵母按 10%的接种量接种在亚硒酸钠浓度依次为 10、 20、 30、 40、 50g/mL 的麦芽汁培养基中，于 28 下进行硒浓度梯度驯化，每代驯化时间为 48h。将驯化好的酵母液接入无亚硒酸钠的麦芽汁培养基中备用。 2.2.3 酵母培养 在
19、初始硒浓度、温度、初始 pH、培养时间等单因素实验基础上，以温度、初始 pH、培养时间为主要因素，采用正交试验获得富硒酵母最大 硒含量的最佳培养条件，之后通过对硒的添加方式优化，来达到酵母有机硒最大转化率。 2.2.4 硒含量测定 测定原理 :在 pH23 条件下，硒与 3， 3-二氨基联苯胺 (DAB)反应形成稳定的 Se-DAB络合物，显色反应在 30min 内完成。在 pH6 左右时，通过甲苯萃取，在该体系中络合物最大吸收波长为 420nm，其吸光度在一定范围与硒浓度成正比。 16可通过分光光度计测定其吸光度，先绘制出标准硒曲线，然后再测出样品吸光度，可从该标准曲线上查出对应的硒含量。
20、(1) 试剂配制： 消化液：按浓硝酸：浓硫酸 =4： 1 配制 ，取 40 mL 浓硝酸，再加入 10 mL 高氯酸 (70% 72% )，转移至棕色瓶中避光贮存。 EDTA-2Na 溶液， 0.2mol/L(5%)：称取 7.4gEDTA-2Na 溶于水中，定容至 100ml，混匀。 3， 3-二氨基联苯胺溶液， 5g/L(0.5%)：称取 0.25gDAB 加少量稀盐酸溶解，最后用水稀释至 50mL。 1:1 盐酸溶液：移取 50ml 浓盐酸，用水定容至 100ml。 5%氢氧化钠溶液：称取 2.5g 氢氧化钠，用水定容至 50ml。 10%硝酸溶液：移取 50ml 硝酸，用水定容至 50
21、0ml。 硒标准 溶液， 0.5mg/ml：准确称取 0.1667g 硒，置于 50mL 小烧杯中，力入 1:1 盐酸 10mL，加热溶解，冷却并转移至 100mL 容量瓶中，用 10%硝酸定容至 100ml。 (2) 标准曲线绘制 准确吸取 0.5mg/mL硒标准液 1ml移入 100ml容量瓶定容至 100ml。再从中准确吸取 0.0、2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0mL，分别移入分液漏斗中，加水至 35mL。分别加入 5%EDTA-2Na溶液 1mL，摇匀，用 1:1 盐酸调节 pH2-3 左右，各加 0.5%3， 3-二氨基联苯胺溶液 4mL，摇匀，置于暗处 30min，再用 5%氢氧化钠溶液调节至中性，加 10mL 甲苯振摇 2min，静置
