1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 光甘草定的提取和提纯的研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 本实验主要 是为了摸索出一条切实可行的光甘草定的提纯工艺，满足社会对光甘草定提纯的的需要 。采用加热超声的提 取方法，用 大孔吸附树脂进行吸附洗脱精制，得出最佳的洗脱条件，以高效液相色谱作为检测纯度 。得到 70%乙醇作为洗脱剂光甘草定纯化后含量为 9.661%。实验表明光甘草定提取的最佳工艺为以乙醇为提取溶液 超声提取，液料比 7： l(mL/g)、提取 2次、提取温度 50、提取时间 30 min、超声功率 500 W，该条件
2、提取光甘草定简便快速而且提取率高，之后大孔吸附树脂吸附后，得到最佳的洗脱液为 70%乙醇，这样能得到最佳纯度的光甘草定。 关键字 : 光果甘草；光甘草定；高效液相色谱 II Abstract: This experiment explore a practical set of purification process of light licorice, licorice light will meet the needs of pure. Use ultrasonic extraction method with heating, adsorption and elution refine
3、 throught macroporous adsorption resin , obtain the best elutropic condition by by acting high performance liquid chromatography (HPLC) as the analysis purity method.obtained with 70% ethanol as the extractant be purified from light licorice content 9.661%.Experiments show that the best extract proc
4、ess is ethanol extraction solution by ultrasonic extraction,by using liquid-material(7: l,mL/g), extracting 2 times, extracting at 50 ,30 min and ultrasonic power 500 W.This light licorice extraction condition is simple and rapid and high extraction efficiency After macroporous adsorptive resin adso
5、rption, get the best eluent for 70% ethanol, this can get a best and highly efficient purified line. Keywords:Glycyrrhiza glabra; Glabridin; High Performance Liquid Chromatography I 目 录 1 绪论 . 1 1.1 甘草的简介 . 1 1.1.1 甘草甜素的作用 . 1 1.1.2 甘草黄酮的作用 . 1 1.1.3 甘草多糖的作用 6 . 1 1.2 光甘草定的简介 . 2 1.3 光甘草定的结构性质 . 2 1
6、.4 光甘草定的药理作用 . 3 1.4.1 抗氧化作用 . 3 1.4.2 动脉粥样硬化和降血脂作用 . 3 1.4.3 神经保护和增强记忆作用 . 3 1.4.4 雌激素样活性 . 3 1.4.5 抑制黑色素形成作用 . 4 1.4.6 减肥作用 . 4 1.4.7 其他药理作用 . 4 1.5 研究的目的及难点 . 5 1.5.1 研究的目的 . 5 1.5.2 研究的难点 . 5 1.6 展望 . 5 2 材料与方法 . 6 2.1 材料和试剂 . 6 2.1.1 材料 . 6 2.1.2 试剂和药品 . 6 2.1.3 实验仪器 . 6 2.2 实验方法 . 7 2.2.1 甘草的预
7、处理 . 7 2.2.2 光甘草定的提取 . 7 2.2.3 提取液的预处理 . 7 II 2.2.4 光甘草定的纯化 . 7 3 结果和分析 . 9 3.1 最佳提取条件的研究 . 9 3.1.1 光果甘草粗提物提取溶剂的研究 . 9 3.1.2 光果甘草粗提物提取方法的研究 . 9 3.1.3 超声温 度对提取率的研究 . 10 3.2 大孔树脂的提纯研究 . 10 3.2.1 大孔树脂类型的选择 . 10 3.2.2 洗脱条件的选择 . 11 3.2.3 动态吸附解吸动力学实验 . 11 3.3 高效液相色谱检测 -光甘草定的纯度鉴定 . 12 3.3.1 标准品溶液的制备 . 12 3
8、.3.2 纯度的分析 . 12 4 结论 . 15 4.1 实验小结 . 15 4.2 实验感想 . 15 参考文献 . 16 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 甘草的简介 甘草又名甜根、蜜草，来源于豆科甘草属，主要 为豆科植物甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草 (Glycyrrhiza inflata Bat)或光果甘草 (Glycyrrhiza glabral)的干燥根及根茎，全世界有 30多个品种，是一种常用的重要中药 1。 甘草 作为药材以沿用了 4000年 2，主要集中分布于我国的三北地区（东北、华北和西北各省区），其中以
9、新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为干草的主要生产区 3。 甘草中的活性成分主要包括 3类：三萜类 (以甘草甜素为主 )、黄酮类和多糖类。 1.1.1 甘草甜素的作用 甘草的主要成分是甘草皂苷，甘草皂苷又称甘 草酸，由于有甜味，又称为甘草甜素。具有保肝和治肝、治疗肾病和心脏疾病、抗病毒、抗菌等作用。抗病毒作用是甘草酸类成分的主要药理作用之一。近年来，有关甘草酸对肝炎病毒、艾滋病毒及其它病毒的作用研究和应用，取得了较大的进展。由于甘草甜素具有高甜度、低热量、起泡性及溶血性较低、安全无毒等优良特性，现已有甘草甜素片制剂正式在临床上用于治疗乙肝。 1.1.2 甘草黄酮的作用 甘草中一种有效成分为黄酮类成分 (
10、1icorice flavonoids)，甘草黄酮类成分具有多种生理功能，如抗氧化作用、抗脂质过氧化、抑制多种肿瘤 细胞的增殖、诱导凋亡等 4。今日研究的对象光甘草定就是黄酮类成分，是光果甘草所特有的异黄酮类成分，它不仅在光果甘草黄酮类成分中含量最高 (占11 )，而且具有良好的药用开发价值，在心脑血管 5疾病的防治药物研究中亦显示出良好的前景。 1.1.3 甘草多糖的作用 6 甘草多糖（ Glyeyrrhiza polysaccharide， GPS）是从甘草中提取出的一类 -D-吡喃多糖。近年来，对甘草多糖的药理作用研究较多。在免疫调节方面：对淋巴细胞、巨噬细胞、 T淋巴细胞的增殖有促进作
11、用；在抗肿瘤方面：能 促进小鼠血清溶血素 IgM 和 IgG 的生成，提高抗体成细胞水平和胸腺、脾脏指数，增强巨噬细胞的吞噬活性，抑制肿瘤细胞 S180 的生长，提示了甘草多糖具有免疫增强和肿瘤抑制作用；在抗病毒方面甘草多糖作为抗病毒制剂，可影响艾滋病病毒合胞体形成，影响腺病毒和柯萨奇病毒的吸附及进入细胞的功能，达到保护细胞作用。 甘草经过我国传统医学长期临床实践验证，确认其具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，可用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽多痰、腹腔和四肢疼痛、2 痈肿疮毒等症，并用之缓解 其它药的毒性 7。 1.2 光甘草定的简介 光甘草定 (Glabr
12、idin)是光果甘草 (Glycyrrhiza glabral)所特有的异黄酮类成分。近年国内外对Glabridin的研究报道较多，此分子在药理实验研究中显示较强的抗氧化、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血压、神经保护、增强记忆、抑制黑色素形成、抗肥胖症可抗菌等作用，从而在心脑血管疾病的防治中以及在化妆品领域内显示出良好的研究开发潜力，并 且在美容方面也有举足轻重的地位 。光果甘草是甘草的品种之一，主要分布在我国西部地区，资源丰富，有野生和人工栽培基地， 储备量较大。其活性成分光甘草定 Glabridin在光果甘草精制总黄酮中含量较高 (约占 11% )，具有较好的研究开发和应用价值。 近年来的研究
13、显示，甘草中所含的异黄酮类成分 -光甘草定 ( Glabridin，图 1-1) 在体内外药理实验中显示较强的神经保护作用，具有较强的抗氧化、抗炎及抗菌、抗动脉粥样硬化和一定的降血脂、降血压等作用 8，不仅可以运用于药学而且在美容方面也有举足轻重的地位。光甘草定是光果甘草中主要黄酮类成分之一，约占总黄酮类成分的 11%，且只存在于光果甘草。光甘草定在细胞色素 P450/NADPH氧化系统中显示出很强的抗自由基氧化作用 ,能明显抑制体内新陈代谢过程中所产生的自由基、以免受对氧化敏感的生物大分子 (低密度脂蛋白 LDL,DNA)和细胞壁等被自由基氧化损伤。 O OO HO HH图 1-1 光甘草定
14、的分子结构 1.3 光甘草定的结构性质 光甘草定 (glabridin)微黄色粉末， mp.233.3 235.5 , 19 9.5 (c0.3,CHCl3)；与 FeCl3 反应显棕色。 TLC:Rf = 0.42( 展开剂 CH2Cl29%/MeOH, Silica gel 60 F254) 。 UV max(EtOH)n m:230,282,322(sh)。 EI-MS m/z(rel. int.,% ):324(M+,31) , 309(M+-CH3,100),187(14), 173(52),136(8);分子式 C20H20O4 , 计算值 : C 74.06;H 6.21; 测定
15、值 :C 74.24; H 6.27 。 IR max 3 (KBr)cm-1:3374,1620,1607,1596,1519 。 1H NMR ( 400MHz,CDCl3) :7.68 (1H, br s,OH),7.48, (1H,brs,OH),6.91 (1H,d,J = 8.2 Hz, 6 -H) 6.81 (1H,d,J = 8.2 Hz,5-H),6.64 (1H,d,J = 9.9 Hz,4 -H) 6.46 (1H,d,J = 2.2 Hz, 3 -H),6.39 (1H, d,J = 8.2Hz, 2.2,5 -H),6.33(1H,d,J = 8.2 Hz,6-H)
16、, 5.55 (1H,d,J = 9.9 Hz, 3 -H) , 4.39 (1H,dd,J = 1.8, 3.2,10.3 Hz, 2-H) ,4.01 (1H,ddd,J = 10.3,10.3 Hz,2-H) ,3.52 ( 1H,m,3-H) ,2.99(1H,dd,J = 11.0, 15.7Hz,4-H) ,2.83 (1H,m, 4-H) , 1.42, 1.40 (3H each,s,5 -and6 -CH3)9。 1.4 光甘草定的药理作用 10 Glabridin的生物活性和药理作用研究目前成为天然黄酮类化合物研究中的一个热点。 1.4.1 抗氧化作用 Glabridin的
17、化学结构具有异黄酮母核， A环和 B环为芳环， B环上有 2个酚羟基， c9-位上有个烯键。因此， Glabridin具有较强的抗氧化活性。 利用肝脏微粒体巾的细胞色素 P450 NADPH氧化系统做体外生物氧化模型，以 Ej由基清除剂银杏叶捉取物 EGB76l做为阳性对照物，观察 Glabridin的抗氧化活性。结果发现， Glabridin以 0.10、 0.25和 0.5 mg ml浓度，分别抑制自由基浓度为 67、73和 83，在较低浓度时，其抗氧化活性与 EGB761类似 。 1.4.2 动脉粥样硬化和降血脂作用 光果甘草提取物及 Glabridin以明显强的抗氧化能力阻止低密度脂蛋
18、白的氧化变质，从而防止动脉粥样硬化症的发生和发展。国外学者经人体试验发现，光果甘草提取物及 Giabridin能降低病人血浆巾的低密度脂蛋白被氧化的易感系数，提高血浆中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝集、抗滞留的能力，从而在病人体内显示明 强的抗动脉粥样硬化和一定的降血脂和降血压作用，可用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的心血管疾病 。 Aoki等 观察含 Glabridin的甘草黄酮油(Licorice flavonoid oil， LFO)对人体的保健作用和安全性，发现 LFO1200 mg/d的剂量对人体是安全的，并具有防治动脉粥样硬化等功效。 1.4.3 神经保护和增强记忆作用 Yu等经
19、体内外药理实验，研究 Glabridin对大脑巾动脉闭塞性脑损伤及星形孢菌素诱导损害的人鼠皮层神经元的保护能力。结果发现， Glabridin以 25 mg kg剂量在两种试验模型中，通过明显降低脑内 MDA浓度和增强内原性抗氧化剂 SOD和 GSH 的活性，显著减轻脑损伤程度，并抑制星形孢菌素诱导的大鼠皮层神经元损伤。 Glabridin对脑细胞的以上保护作用具有剂量依赖性特点。 1.4.4 雌激素样活性 Glabridin具有类似雌激素的结构特点，能产生雌激素样活性。 Snait等经动物实验研究发现，4 Glabridin作为一种植物性雌激素，能够进入予富细胞内的雌激素受体，产生类似雌激素
20、的生物活性，其以 2 5 25 mg/每只老鼠的剂量所产生的雌激素活性强度与 5 mg/每只动物的雌二醇相当。Somjen等经体内外试验研究发现， Glabridin在 m管组织内对人血管平滑肌细胞的增殖产生双向雌激素样作用，其作用特点类似于雌激素雷洛昔芬 (raloxifene)。 1.4.5 抑制黑色素形成作用 Yokota等观察 Glabridin在 B16黑色素瘤小鼠体内对黑色素细胞形成和炎症发生以及对豚鼠皮肤的影响。结果发现， Glabridin以 0.1 1.0 g ml的浓度显著抑制酪氨酸酶的两种亚型一 T1和 T3 tyrosinase的活性，并产生显著的抗炎作用，对皮肤产生明
21、显的增白效果，从而在化妆品领域内显示良好的应用价值。现 Glabridin已成为许多高级化妆品的主要增白成分。 1.4.6 减肥作用 Aoki 等对含 Glabridin的甘草黄 酮油 (LFO， 1 2 的廿草黄酮与甘油三酯混合而成 )对肥胖老鼠的减肥效果进行实验研究，结果发现 LFO经 8周用药后，明显减少腹部堆积的白色脂肪含量。 1.4.7 其他药理作用 Jong等研究发现， Glabridin对于在脐静脉内皮细胞内肿瘤坏死因子一 (TNF )刺激所引起的细胞间粘附分子 -1(Intercellular adhesion molecule-1， IcAM-1)的表达产生抑制作用。 Fuk
22、ai等在患有肾小球疾病的小鼠模型巾，观察 Glabridin对血象的影响，通过以 3O mg kg d 的剂量 10d给药治疗发现，用 Glabridin治疗组对蛋白尿的降低率 (47 4)mg/d明显高于对照组 (100土 23)mg/d，即Glabridin对肾炎有治疗作用。 Glabridin通过抑制细胞色素 P450家族中的有关氧化代谢酶的活性，对有些致癌物的激活有抑制作用。 Gupta等 对光果甘草提取物的抗菌活性进行实验研究，即总提取物的有效制菌浓度为 500 g/ml，而经有效成分的跟踪研究发现，总提取物中的异黄酮 Glabridin的制菌有效浓度为 29g ml，即 Glabr
23、idin的制菌强度不但比总提取物约强 18倍，而且对包括结核杆菌在内的格兰氏阴性和阳性细菌都具有广谱的抗菌活性。 此外， Glabridin通过阻断 NF-kappaB/Rel的激活途径抑制一氧化氮 (N0)的产生和一氧化氮合酶(iNOs)基因的表达。 Glahridin跟其它植物性雌激素一样，在 HEK一 293细胞内抑制 5一羟色胺的重吸收，其活性强度比已知的植物类雌激素金雀异黄素 (genistein)和大豆苷元 (daidzein)要强，此结果显示， Glabridin对女性更年期综合征具有防治潜能。 5 1.5 研究的目的及 难点 1.5.1 研究的目的 （ 1） 选择光甘草定含量高
24、的甘草，在符合我国医药工业生产要求的前提下，提取与精制光甘草定，产品纯度要求：光甘草定含量达到 10%以上。 （ 2）同时光甘草定提取率稳定、使用的提取及纯化试剂基本可以回收，选用最简单方便的方法提取并获得最佳的提取方法。 1.5.2 研究的难点 尽管现在关于提取 提纯 的方法较多，但具体什么方法适合光甘草定的提取还是个未知数， 提纯 的条件不确定，使得 提纯 的工作量比较大，增加了实验的难度； 提纯 后光甘草定的测定工作量大，同时光甘草定的 提纯 易受其他条件的影响。提取精制 后光甘草定，产品纯度要求：光甘草定含量达到 10%。同时光甘草定提取 率稳定、使用的提取及纯化试剂基本可以回收。 1
25、.6 展望 Glabridin的抗氧化、降血脂、抗炎等作用在阻止心血管疾病的病理基础， LDL脂蛋白的氧化、血管内皮细胞被炎症因子损伤和高脂血症等方面具有重要意义，这使 Glabridin在人类疑难症 -心血管疾病的有效药物干预中将拥有重要研究价值； Glabridin的抗脑损伤、保护神经细胞和提高认知能力等生物活性使它在老年痴呆症的创新药物研究中显示较好的研究潜力； Glabridin的抑制酪氨酸 酶和抗炎活性使它在化妆品 11原料研究开发中体现重要价值。 Glabridin是光果甘草所特有的一种黄酮类活性成分。光果甘草主要分布在我国西部地区，资源丰富，有野生和人工栽培基地，储备量较大。 Glahridin是在光果甘草精制总黄酮中含量最高的成分，约占 11%，有较好的开发应用价值。光甘草定被广泛应用于化妆品、食品药品等行业，药理活性和经济价值越来越受到重视，而现有研究光甘草定提取工艺条件的文献很少，因此有必要对光甘草定的提取最佳工艺条件做更深入的研究，并有很良好的应用发展前景。
