1、 本科 毕业论文 （ 20_ _届） 基于壳聚糖和 HRP的新型葡萄糖生物传感器的研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 壳聚糖生物相容性好，对酶有很好的亲和力，并能有效防止酶的渗漏，因此本论文中将壳聚糖和葡萄糖氧化酶固定在 电极表面。 葡萄糖氧化酶催化溶液中的葡萄糖发生氧化反应生成 H2O2，溶液中的辣根过氧化酶 (HRP)催化生成的 H2O2分解成羟基自由基 ， 羟基自由基不可逆地氧化非电活性的 Amplex UltraRed生成水和具有电活性的 resorufin（ 7-羟基 -3H-吩噁 -3-嗪酮 ）。 Resorufin在
2、大约 -0.1V（ vs.SCE）发生一个可逆的 2电子还原的化学反应生成 dihydroresorufin而被检测，从而达到间接地检测葡萄糖的目的。将 Amplex UltraRed用于基于酶的生物传感器的电化学研究，致力于制备响应 时间更快，灵敏度更高的葡萄糖传感器。我们使用 生物相容性好，对酶有很好的亲和力，并能有效防止酶的渗漏的壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定在电极表面从而制得一种新型的葡萄糖传感器，并对此电极的电化学性质进行了研究。该修饰电极对葡萄糖具有良好的电催化氧化作用 ,氧化峰电流的大小与葡萄糖的浓度呈良好的线性关系 ,线性范围是 0.8mol/L 324mol/L,最低检测限是 0.
3、4mol/L(S/N=3),米氏常数是 21.78mol/L。 关键词 : 壳聚糖 辣根过氧化酶 (HRP) 葡萄糖传感器 II Abstract: Novel Electrochemical Assay for Glucose Biosensor Based. Amplex UltraRed and Horseradish Peroxidase. A novel method for low-level, low-potential electrochemical detection of glucose using a chemically activated redox mediator
4、 has been developed. This method is unique in that it utilizes a fluorogenic peroxide substrate, Amplex UltraRed (N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine),Upon peroxidase catalyzed turnover of H2O2 with Amplex UltraRed,the fluorescent and electroactive product resorufin (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one)was
5、detected amperometrically in a thin-layer flow cell with high selectivity. And its electrocatalytical behavior were also studied by electrochemical methods. It showed that the modified electrode had excellent electrocatalytical effect to glucose. A linear detection range from 0.8 mol/L through 324mo
6、l/L was obtained and the detection limit of 0.4mol/L.The apparent Michaeli-Menten constant was 21.78mol/L. Keywords: Amplex UltraRed HRP glucose biosensor 目 录 摘要 Abstract 1 绪论 . 1 2 实验部分 . 3 2.1 试剂 . 3 2.2 仪器 . 3 2.3 葡萄糖传感器的制备 . 3 3 结果与分析 . 4 3.1 Amplex UltraRed 和 HRP 对 H2O2 的电催化性质研究 . 4 3.2 Amplex
7、UltraRed 和 HRP 催化 H2O2 的催化机理探讨 . 5 3.3 新型 GOD/CHIT 葡萄糖传感器对葡萄糖的检测 . 7 3.4 新型 GOD/CHIT 葡萄糖传感器的选择性 . 7 3.5 新型葡萄糖传感器对葡萄糖检测的重现性和稳定性 . 8 4 结论 . 10 参考文献 . 11 1 1 绪论 葡萄糖是生命活动中不可缺少的 一种 物质，它在人体内能直接参与新陈代谢 过 程 ，是 机体所需能量的主要来源， 它 在体内被氧化成二氧化碳和水并同时供给热量，或以糖原形式贮存。 它 能补充体内水分和糖分 ,具有补充体液、供给能量、补充血糖、强心利尿、解毒等作用 ， 还 能促进肝脏的解
8、毒功能，对肝脏有保护作用。 糖尿病最常见的症状是糖代谢的混乱，它会导致血糖浓度的升高，如果得不到控制，就会引起生命危险。 血糖只是指血液中的葡萄糖而言，不包括果糖、半乳糖等单糖。正常人血糖处于动态平衡状态，也就是说血糖只是在一个狭窄的范围内变动。多数人空腹血糖多在 3.3 6.1mmol L 之内，餐后半小时及 1 小时血糖不超过 11.11mmol L 范围。血糖的 来源包括食物消化、吸收、肝内储存的糖原分解、从脂肪和蛋白质糖异生等。血糖的去路，包括氧化转为能量 ;转化为糖原储于肝脏、肾脏和肌肉中；转变为脂肪和蛋白质等其他营养成分加以储存。人体调节血糖的重要系统和器官包括内分泌神经系统。肝脏
9、能通过储存和释放葡萄糖来调节血糖，神经系统可通过对糖类的摄取、消化、利用和储存等直接作用来调节血糖；也能通过内分泌系统间接影响血糖；而内分泌系统则可分泌多种激素调节血糖。肝脏、神经和内分泌系统共同合作，维护着血糖的稳定。目前只有通过控制血糖浓度的方法来控制糖尿病发病率，因此创建一种快速 、稳定、精确测定血糖浓度的方法成为研究者关注的焦点。 1962 年， Clark 和 Lyons1首先提出酶与电极结合的设想，他们将酶溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层，再紧贴在 pH 电极、氧电极和电导电极上，用于监测液层中的反应： 1967年Updike和 Hicks2采用当时的最新方法，将葡萄糖氧化酶
10、固定在氧电极表面，研制出世界上第一支葡萄糖传感器，从此，能简便、快速、准确地测定葡萄糖浓度的葡萄糖氧化酶 (GOD)传感器的研究一直都是人们关注的热点。近年来，葡萄糖传感器的研究领域取得了较突出的 进展 朱邦尚 3等选用 B-环糊精与戊二醛缩合成的 B-环糊精聚合物 （ B-CDP） 为主体，电媒介体， 12-二甲基二茂铁为客体，形成稳定的主客体包络物。用牛血清白蛋白 /戊二醛交联法，把葡萄糖氧化酶和主客体包络物固定到电极上，传感器的稳定性和使用寿命显著提高。采用铂丝电极经铂化处理制备的杂聚吡咯 /GOD膜，葡萄糖酶电极稳定性良好，间断测定 3 个月，灵敏度仍达原来的 70%左右。张国林 4等
11、采用乙基纤维素和乙炔黑导电复合材料制备固定化葡萄糖酶电极。结果表明：用环己烷洗去石蜡的导电复合材料 /葡萄糖氧化酶生物传感器 具有粒状结构，有利于酶催化反应。利用普鲁士蓝（ PB）膜修饰的铂盘葡萄糖电极能有效消除抗坏血酸、尿酸的干扰。蔡新霞 5等将锇氧化还原聚合物与辣根过氧化酶共价交联修饰薄膜金电极，使用戊二醛交联固定葡萄糖氧化酶制得葡萄糖2 传感器。该传感器在 -0.1V（ vs.Ag/AgCl） 电位下，背景电流小于 1nA，检出限为 1M，小于 400M范围内灵敏度为 2900（ M/mol/L） （相关系数 R=0.998），实现了低浓度葡萄糖的测定，为发展高灵敏度、低检测限、高稳定性
12、的无创血糖检测传感器奠定了基础。 陈洪渊研究小组 6报 道了一种通过在电极上沉积壳聚糖分散的 MnO2纳米粒子制备的葡萄糖安培传感器，它能够有效地减少抗坏血酸的干扰；沈国励研究小组 7利用多壁碳纳米管和铁氰酸镍纳米颗粒电化学氧化还原活性的协同作用形成复合成分，制备了葡萄糖传感器，提高了传感器的电催化性能；朱俊杰研究小组 8通过电沉积法将普鲁士蓝以及壳聚糖一纳米金一葡萄糖氧化酶复合层固定在电极上制备了葡萄糖传感器，取得了良好的效果。 使用氧化还原媒介体需要使用指示剂，为避免指示剂可能具有氧化还原性质而产生的争议 ,我们使用了本身没有电活性的媒介体 （ Amplex UltraRed） ,它能被酶
13、与底物作用产生的 H2O2氧化产生具有电活性的物质 （ resorufin， 7-羟基 -3H-吩噁 -3-嗪酮 ） 9。 Resorufin在大约 -0.1V（ vs.Ag/AgCl）10发生一个可逆的 2电子还原的化学反应生成 dihydroresorufin11而被检测。在这里， H2O2氧化Amplex UltraRed的反应计量比是 1:1，由于生成 resorufin， H2O2可以在更低的还原电位下被检测。此传感器有效避免了其他具有更高氧化电位的电活性物质的干扰，提高了电极的寿命，降 低了溶液由于 pH变化而引起的水在高过电位下的发生的氧化还原反应。 本文中 我们试图将 Ampl
14、ex UltraRed用于基于酶的生物传感器的电化学研究，致力于制备响应时间更快，灵敏度更高的葡萄糖传感器。我们使用 生物相容性好， 对酶有很好的亲和力，并能有效防止酶的渗漏的壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定在电极表面从而制得一种新型的葡萄糖传感器，并对此电极的电化学性质进行了研究。由于 Amplex UltraRed和 HRP的引入，使得该传感器具有较低的工作电位，避免了大多数还原性物质的干扰。实验结果表明，该传感器具有较高的 灵敏度及良好的抗干扰能力，并且具有制备简单，稳定性好，响应时间短等特点。 3 2 实验部分 2.1 试剂 Amplex UltraRed(Invitrogen,A36006,
15、51mg); 辣根过氧化酶 （ HRP,上海丽珠东风生物技术有限公司 ） ; 过氧化氢 （ 30%H2O2, 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ,AR ） ; 葡萄糖氧化酶（ GOD,EC1.1.3.4,133600U/g, type -S from Aspergillus niger, Sigma） ;葡萄糖 （ C6H12O6H2O）； 二甲亚砜 （ 上海东 懿化学试剂公司 ）； 壳聚糖（ CHIT， 10mg/mL，用 1醋酸配成）；多巴胺 (DA, Sigma);抗坏血酸（ AA, Sigma）； 300U/mL HRP 溶于 0.1M K2HPO4/0.05M 柠檬酸的
16、缓冲（ McIlvaine buffer，pH 5.0）储备液，实验时稀释至 0.2 U/mL; 其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2.2 仪器 电化学实验所用仪器为 CHI832B电化学分析仪（ CHI公司，美国）， 论文中所有的 电化学实验均采用 三电极体系：以玻碳电极（直径 3mm，日本东海株式会社）作电极，饱和 甘汞电极（ SCE，江苏电分析仪器厂）为参比电极，铂电极为对电极。 2.3 葡萄糖传感器的制备 将玻碳电极分别用金相砂纸，氧化铝粉末 (0.05m)在麂皮上打磨抛光成镜面后，用二次去离子水冲洗，然后在硝酸 (1:1 体积比 )，氢氧化钠溶液 (1.0mol/L)，丙酮
17、及去离子水中各超声洗涤 5min，晾干待用。 称取 0.1g 壳聚糖置于小烧杯中，加入 1的醋酸溶液 10mL 并搅拌 2h，得到粘稠的 10mg/mL壳聚糖溶液， 取此溶液和葡萄糖氧化酶溶液等体积混合，取 2L滴加到玻碳电极上，自然晾干，待用。 4 3 结果与分析 3.1 Amplex UltraRed 和 HRP 对 H2O2 的电催化性质研究 用循环伏安法考察了 Amplex UltraRed 和 HRP 对双氧水的催化性质。图 1 是玻碳电极在 含0.2U/mL HRP 的 pH 5.0 McIlvaine buffer 中 在 未加入（ a,b）和 加入 (c,d)Amplex Ul
18、traRed 时对1.010-3mol/L H2O2 的循环伏安图。在未加入 Amplex UltraRed 时，在 -0.4V0.2V 电位区间内 HRP对 H2O2 并 没有催化 效应（图 1c）。而当溶液中有 Amplex UltraRed 存在时（图 1d），当扫描速率是 100mv/s 时， resorufin-dihydroresorufin 电对的 阳极电位 Ep,a 和阴极电位 Ep,c 分别是 -0.117V 和-0.174V，表观电动势 E0 是 -0.146V， E0=1/2(Ep,a+ Ep,c)，峰峰电位差 Ep 是 57mV， 这说明确实是溶液中的 Amplex U
19、ltraRed 催化 H2O2 的。 图 1 玻碳电极 在含 0.2 U/mL HRP(a,b)及 0.2 U/mL HRP 和 50 mol /L Amplex UltraRed（ c,d） 的 McIlvaine buffer 缓冲溶液中对未加入（ a,c）和加入 H2O2(b,d)时的循环伏安曲线，扫描速率： 100mv/s Fig.1 Cyclic voltammograms of H2O2 and HRP in the McIlvaine buffer without(a,b) and with (c,d) Amplex UltraRed, scan rate:100mv/s 5 我
20、们还用 i-t 法考察了 Amplex UltraRed 和 HRP 对 H2O2 的催化还原。图 2 是玻碳电极 在含 0.2 U/mL HRP 和 50 mol/L Amplex UltraRed 的 McIlvaine buffer 缓冲溶液 (pH 5.0)中对 H2O2 的 i-t 曲线 ，工作电位为 -0.1V。 在 2.010-7mol/L 3.010-5mol/L 范围内还原峰电流与 H2O2 浓度呈现出良好的线性关系 ，相关系数是 0.9964，检测下限为 1.010-7mol/L（ S/N 3）。 3.2 Amplex UltraRed 和 HRP 催化 H2O2 的催化机
21、理探讨 图示 1 为通过 Amplex UltraRed 检测氧化酶产生的 H2O2 的信号转换方式 ： 葡萄糖氧化酶催化溶液中的葡萄糖发生氧化反应生成 H2O2， 溶液中的辣根过氧化酶 (HRP)催化生成的 H2O2 分解成羟基自由基 ， 羟基自由基不可逆地氧化 Amplex UltraRed 生成水和具有电活性的 resorufin。 Resorufin在大约 -0.1V（ vs.SCE） 发生一个可逆的 2 电子还原的化学反应生成 dihydroresorufin 而被检测，从而达到间接地检测葡萄糖的目的。 图 2 H2O2 在含 0.2 U/mL HRP 和 50 mol /LAmpl
22、ex UltraRed 的 McIlvaine buffer 缓冲溶液中的 i-t 曲线 ;内插图： icat 对 CH2O2 的线性图 Fig.2 Chronamperometric curve of H2O2 for I-t at an operating potential of -0.1V. Inset: plot of catalytic current vs. H2O2 concentration 6 其中 Amplex UltraRed 在 HRP 催化下发生如下的反应： 图示 1 用 Amplex UltraRed 媒介体检测由酶产生的 H2O2 的示意图 Scheme 1. Depicition of Enzymatically Generated H2O2 Detection Using the Amplex UltraRed Mediator
