1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然红色素抑菌活性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要 : 灵菌红素是一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的具有重要生物活性的次级代谢产物。 由于其生物学特性，除了在抗肿瘤，免疫 抑制等医疗方面有较高的研究价值外，其作为一种天然色素以及天然抑菌剂，在纺织业，畜牧业也有较好的发展前景。本研究主要测试了灵菌红素对一些常见的细菌的抑菌能力，确定其最小抑菌浓度及杀菌浓度，从而为其作为生态染料，饲料添加剂等研究方向提供参考。实验结果表明，其对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有较好的抑菌效果，而对
2、大肠杆菌抑菌效果不显著。 关键词 : 灵菌红素；抑菌性；最小抑菌浓度 ；最小杀菌浓度 Abstract: Prodigiosins with important biological activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serratia and other bacteria. Because of the biological characteristics, prodigiosin is used as antitumor medicine, immunosuppressive a
3、gent and other medical research. As a natural pigment and natural antimicrobial agent, prodigiosin possesses good prospects for development in the textile industry, animal husbandry. The study tested the antimicrobial activity of prodigiosin on some common bacteria, and determined the minimum inhibi
4、tory concentrations and bactericidal concentration, so the results provided reference to other research such as dyes, feed additives and so on. The results showed that prodigiosin had a good antibacterial effect on Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria, however it
5、 hadnt obviously inhibitory effect on E. coli. Keywords: Prodigiosin; antibacterial property; MIC， MBC 目 录 摘要 错误 !未定义书签。 Abstract 错误 !未定义书签。 1 绪论 错误 !未定义书签。 1.1 灵菌红素简介 错误 !未定义书签。 1.2 灵菌红素的理化性质 错误 !未定义书签。 1.2.1 灵菌红素抗真菌作用 错误 !未定义书签。 1.2.2 灵菌红素抗细菌作用 1 1.3 灵菌红素的应用 1 1.3.1 灵菌红素抗疟疾活性 1 1.3.2 灵菌红素抗肿瘤作用 2 1
6、.3.3 灵菌红素免疫抑制剂活性 2 1.4 灵菌红素的应用前景 2 1.4.1 在食品上的应用 2 1.4.2 在纺织染工业的应用 3 1.4.3 灵菌红素在动物饲料方面的应用 3 1.4.4 在医学临床上的应用 3 2 实验部分 4 2.1 实验器材 4 2.1.1 菌种 4 2.1.2 实验仪器 4 2.1.3 实验药品 4 2.2 分析方法 4 2.3 实验内容 4 2.3.1 灵菌红素提取 5 2.3.2 抑菌实验准备 6 2.3.3 指示菌菌悬液的制备 6 2.3.4 最小抑菌浓度的测定 7 2.3.5 最小杀菌浓度的测定 7 3 结果与分析 8 3.1 灵菌红素溶液对大肠 杆菌抑
7、菌的测定 8 3.1.1 最小抑菌浓度 (MIC) 8 3.1.2 最小杀菌浓度（ MBC） 8 3.2 灵菌红素对枯草芽孢杆菌抑菌的测定 10 3.2.1 最小抑菌浓度 (MIC) 10 3.2.2 最小杀菌浓度（ MBC） 10 3.3 灵菌红素对金黄色葡萄球菌抑菌的测定 12 3.3.1 最小抑菌浓度 (MIC) 12 3.3.2 最小杀菌浓度（ MBC） 12 4 结论 错误 !未定义书签。 参考文献 错误 !未定义书签。 致 谢 错误 !未定义书签。 1 绪论 1.1 灵菌红素简介 灵菌红素 (prodigiosins)又名灵菌素、灵杆菌素，分子式为 C20H25N30 (M=323
8、 1968)，具有三吡咯环骨架结构 1-2，根据其侧链基 链基团结构的不同，灵菌红素族还 包括 prodigiosin，prodigiosim25-C， metacycloprodigiosi(nMP)desmethoxyprodigiosin和 uncedylprodigiosin(UP)等一系列结构和性质相似的物质。 灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，是一些放线菌及其他细菌的次级代谢产物，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌、和抗疟疾等多种生物活性 3-4。 1.2 灵菌红素的理化性质 PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱 性水溶液中微溶，在极性较弱的
9、有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG 对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； Al3+， Ca2+， K+ ， Ba2+ 等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn2+ 有使 PG 增色的作用， Mg2+ 和 Mn2+ 对 PG 有一定的破坏作用， Pb2+ 可以络合 PG，使之成为沉淀 5；白光和蓝光使 PG 发生光解，在红光和远红光下 PG 则不会降解 6。 1.2.1 灵菌红素抗真菌作用 研究发现 MS-02-063菌株能产生大量的灵菌红素类似物 PG-L-1，通过 NCCLS法研究其体外抗真菌活性 7，研究结果表明，尽管其最小抑制
10、浓度值比联苯苄唑微微要高，但却显示出了抗医学上分离的 9种 Trichophyton的菌株的能力，尽管 PG-L-1导入角质层表皮的效率比联苯苄唑要低，但在低浓度下却显示出了更大的抗真菌潜力。 1.2.2 灵菌红素抗细菌作用 PG 具有抗细菌（ antibacterial）、抗真菌（ antifungal）的生物活性 7-8。 Cang 等以沙雷菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀灭作用。 PG 结构类似物具有 显著的抗 Trichophyton spp.等真菌的活性，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用 5 。
11、 1.3 灵菌红素的应用 1.3.1 灵菌红素 抗疟疾活性 Isaka等从 Streptomyces spectabilis BCC 4785的发酵产物中分离得到的 MP有显著的抗疟疾活性。 体外实验表明，其抑制 Plasmodium falciparum K1 的 IC50为 0.00500.001 0g/mL1,9 灵菌红素的应用非常广泛，例如 Nobutaka Someya等研究了植物附生微生物产灵菌红素在生物控制过程中的作用的稳定性，实验分析了抗药灵菌红素的 16sRNA与假单胞菌，根瘤菌等同属。实验结果显示，固有附生植物微生物可能可以通过削弱药物抗生素的能力从而妨碍植物病原体与生物控
12、制药物的相互作用。 Tsukuba等 10从沙雷氏菌中提取疾病抑制基因导入启动子控制的稻米细胞，发现这些基因修饰过的微生物能不受生物及非生物因素影响而有效抑制由 Pyricularia oryzae引起的稻米爆发性疾病 ；也可作为一种新型的饲料添加剂， 纺织工业中的染料，具有稳定 性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等优点，目前正在开发应用当中 11。 1.3.2 灵菌红素抗肿瘤作用 PG具有有效的抗肿瘤活性，美国国立癌症研究所 (NSI)Melvin等发现 PG在平均 IC50为2.1molL-1时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞株中
13、的 57种不同的人癌细胞均有抗性作用。 Zhang 等 12研究了灵菌红素对胰腺恶性肿瘤细胞株 8898 的抑制作用，研究表明，灵菌红素在较低的浓度下即可对 8898 胰腺癌细胞的增殖产生明显抑制，而 且，与非肿瘤细胞的Swiss-3T3 细胞的平行实验表明灵菌红素对肿瘤细胞具有一定的特异性抗细胞增殖的作用，而非肿瘤细胞对于灵菌红素的作用敏感性较低。 1.3.3 灵菌红素免疫抑制剂活性 13 链霉菌属和沙雷氏菌生产出红色物质包括灵菌红素 metacycloprodigiocin， prodigiosene，methoxyprodigiosin和灵菌红素 25 - C。具有抗疟疾的抗菌活性，尤其
14、是灵菌红素 25 - C显示了抑制免疫的作用。灵菌红素对 T淋巴细胞的免疫反应有抑制效果，灵菌红素在其有效浓度范围没有显示毒 性。因此，灵菌红素可以用来作为免疫抑制或在各个领域的标准物质，包括免疫疾病的治疗需要，器官或组织移植和免疫细胞为基础的疾病研究 。 1.4.灵菌红素的应用前景 1.4.1 在食品上的应用 色素可以作为一种食品添加剂，人类最初使用的都是天然色素，但是随着合成色素发明之后，逐渐取代了天然色素。但是，随着人们生活水平的提高，人们对饮食安全越来越注重，发现合成色素使用过量有致癌的危险，对人体有巨大的危害。而天然色素作为食品添加剂，具有安全性，无毒，色泽鲜艳，还具有一定的营养和药
15、理保健作用，有完全取代合成色素的潜力。 1.4.2 在纺织染工业的应用 研究表明，使用灵菌红素来染色，其结果比其他染料的颜色更易上色，更鲜艳，耐洗等优点，还有，灵菌红素本身具有抑菌性等性能，对被染色的纺织物有杀菌的作用，对人体更安全。而且，灵菌红素在纺织染色上使用的纯度要求并不高，对色素的分离提取要求较低。但是，灵菌红素对光具有光敏性，在光下，易分解 14。 随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需求日益扩大，为了满足社会需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 15， 灵菌红素是一种天然色素，可以作 为纺织工业中的染料，具无毒无公害，具抗菌性能，符
16、合社会需求的纺织品用天然抗菌剂的要求。具有稳定性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等优点，目前正在开发应用当中 16。 总之，灵菌红素在纺织上的应用前景较大。 1.4.3 灵菌红素在动物饲料方面的应用 随着畜牧业规模化、商业化的发展，开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。灵菌红素作为无公害天然抗生素，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，不干扰肠道正常菌群的微生态平衡，促进畜禽增重以及提高饲料转化率效果显著； 化学性质稳定，不残留或极 少残留于畜产品中；细菌或寄生虫不易对其产生耐药性，与其他抗生素不产生交叉耐药性；毒性低，安全范围大，对人畜无害，且有抗癌、抗突变突变等作
17、用 17，-18，作为一种新型的饲料添加剂，具有广阔的发展前景。 1.4.4 在医学临床上的应用 根据灵菌红素的生物活性，抗肿瘤性，免疫抑制性，抑菌性等，在医学上有着巨大的前景。但是灵菌红素在医学上的应用，需要很高的纯度，必须通过国家药用标准，这对灵菌红素的下游的分离提取有严格的要求。 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 PG 的生物合成途径及其调节， 1983年 Feitelson 等 19克隆了天蓝色链霉菌与 PG 合成相关的基因簇， Thomason 等 20则首次将分离得到的 Serratia PG 生物合成基因转入欧文氏菌（ Erwinla carotovora）质粒
18、，成功表达并得到了 PG。 2 实验部分 2.1 实验器材 2.1.1 菌种 金黄色葡萄球菌，大肠杆菌 ，枯草芽孢杆菌 2.1.2 实验仪器 表 1 主要仪器 编号 名称 型号 品牌或产地 1 恒温摇床 QYC-211 太仓 2 电子天平 FA-1004 上海 3 蒸汽灭菌锅 DSX-280 上海宜 川 4 冰箱 BCD-190GB 韩国三星 5 洁净工作台 VS-1300 宏瑞 6 微量取液器 BIDHIT 上海 7 分光光度计 722 型 上海棱光 8 电热锅 CL-80 嘉兴 2.1.3 实验药品 表 2 主要试剂 序号 名称 产地 1 蛋白胨 浙江海川 2 酵母粉 上海 3 二甲亚砜
19、上海 4 琼脂 上海 5 氯化钠 上海 2.2 分析方法 灭菌 实验所用的培养基，枪头，培养皿，试管，针筒，过滤器，离心管，镊子等均进行高压灭菌 .然后 取倍数稀释法确定其最小抑菌浓度 MIC， 转接高于未长菌浓度培养基中的液体于新培养基中以确定其最小杀菌浓度 MBC，实验结果长菌表示为 +， +越多表示菌越浓，-表示未长菌。 2.3 实验内容 2.3.1 灵菌红素提取 实验室小量制备灵菌红素：采用普通的牛肉膏蛋白胨培养基，再加甘油，具体配方见表2-3,过程见图 2-1。制备时，采用 500ml 摇瓶摇床发酵制备，见图 2-2。分离制备灵菌红素粗品用旋转蒸发仪收集丙酮，仪器如图 2-3。 表 2-3 液体培养基配方 药品 数量 酵母粉 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 水 1000ml pH 7.4 7.6 甘油 12ml
