1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然色素发酵工艺优化 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 天然色素发酵工艺优化 摘要 : 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的 具有重要生物活性的次级代谢产物。本实验通过单因子和 PLACKETT-BURMAN，爬坡响应面 实验设计，对沙雷氏菌发酵工艺进行研究，发现通过提高蛋白胨浓度并降低氯化钠的含量可以大幅提高灵菌红素产量 ,并找到了一个优于现有配方的培养基配比，使灵菌红素产量提高了 42.85%。 关键词 : 灵菌红素；沙雷氏菌；培养基优化； II
2、Natural pigment fermentation process optimization Abstract: Prodigiosins with important biological activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serratia and other bacteria. Through the investigation of single-factor experiment and PLACKETT-BURMAN design, Conditions of fe
3、rmentation of Prodigiosins were investigated. It was found that by increasing the concentration of peptone and decreasing the concentration of sodium chloride can heavily increase the production of Prodigiodins. And under the new formula, the yield of prodigiodins was improved 42.85% higher than the
4、 control. Keywords: prodigiosins; Serratia; medium optimization; 目 录 摘要 : . I Abstract: . . II 1 绪论 . 1 1.1 灵菌红素的基本性质 . 1 1.2 背景及意义 . 1 2 方法与材料 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.1.1 菌种 . 3 2.1.2 主要仪器与试剂 . 3 2.1.3 培养基 . 3 2.2 实验方法 . 3 2.2.1 种子的培养和优化 . 3 2.2.2 种子的扩大培养 . 4 2.2.3 红色素与菌体的提取 . 4 2.2.4 灵菌红素含量测定 . 4 2.2.5
5、 灵菌红素吸光度标准曲线测定 . 4 2.2.7 PLACKETT-BURMAN 实验 . 5 3 结果与分析 . 7 3.1 标准曲线的测定 . 7 3.2 单因素实验 . 7 3.3 PLACKETT-BURMAN 实验 . 11 3.4 爬坡实验 . 12 3.6 验证实验 . 14 4 结论 .15 参考文献 . 16 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 灵菌红素的基本性质 灵菌红素 (prodigiosins,PG)是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 pro
6、digioSin， prodigio Sin 25-C，metacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi 和 uncedy1prodigiosin(UP)等。 PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG 对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大 1； A13+， Ca2+， K+， Ba2+等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn2+有使 PG 增色的作用， Mg2+和 Mn2+对 PG 有一定的破坏作用，
7、Plackett-Burman2+可以络 PG，使之成为沉淀 2；白光和蓝光使 PG 发生光解，在红光和远红光下 PG 则 不会降解 3。 1.2 背景及意义 PG 是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 4， 5，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、等活性 6。 PG 的产生在菌体生长代谢过程中的作用目前尚有争议，有学者认为 PG 的产生有利于菌体的生存竞争，但也有学者认为， PG 在菌体生长代谢过程中不起作用，仅为大量初级代谢产物的溢流作用。 近年来灵菌红素在医学上、环境治理 、食品色素 以及 纺织 业上的应用越来越广泛。 首先，医学上抗肿瘤作用。 PG 对比起另外一些化学疗法药剂，
8、如 环磷琉胺 （ cyclophosphamide）具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM 时才具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高 7。 它能在 铜 离子配合下破坏癌细胞的双链 DNA。而癌细胞相比非癌组织具有较高的铜离子浓度（ 3.5 倍），这也成为 PG 对癌组织高针对性的基础。 PG 还 可以通过抑制细胞中型拓扑异构酶I 和 的活性而进一步达到破化 DNA 复制的目的。 PG 可破化细胞内的 线粒体 ， 高尔基体 和 溶酶体 对细胞 质的 pH 梯度，降低细胞内 ATP 水平。这是由于 其 可以在这些细胞器的膜上起到离子孔的作用，而抵消氢氯离子的同向转运
9、8。 灵菌红素可以激活细胞内 细胞凋亡 途径 9。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8，继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面，它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ AIF）而触发非半胱天冬酶依赖的细胞凋亡 10。 其次，在环境治理上 11，韩国科学家于 1996 年首次在海洋中发现一种微生物 “ 哈赫拉 ”（ Hahella）。基因组测序分析后发现 其 能产生可以清除赤潮的灵菌红素。将灵菌红素撒在赤潮中，2 只需十亿分之一的浓度， 1h 后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。这对治理 河湖的富营养化及海里的赤潮，维护地球环境具有 重大 意义。 韩国科学家已为 其 申请了韩国和
10、国际专利。 再次，作为 食品添加剂 12，合成色素发明之后，天然色素逐渐被取代。随着毒理学和分析技术的不断发展和人们生活水平的提高，发现某些合成色素食用过量有致癌危险，而天然色素具有较高的安全性 。可是 ， 天然色素不能满足现代食品工业发展的需要，开发新品种 以及改进原有 的天然色素 （如灵菌红素）迫在眉睫。 最后， 在纺织业方面 13，现如今，随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需求日益扩大，为了满足社 会需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 。 3 2 方法与材料 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 黏质沙雷氏菌 ( Serratia jx
11、.1) 2.1.2 主要仪器与试剂 HD-930 组合式全温度震荡培养箱 （大仓市博莱特实验仪器厂）； VS-15000CFN II 型小型高速离心机（ 上海民仪电子有限公司 ）； VS-1300 型洁净工作台（苏州时速为净化设备有限公司）； PHS-3C 型精密 pH 计（上海安亨昌吉 149 号雷磁仪器厂）； AL-204 型电子天平（梅特勒 -托 利多仪器上海有限公司）； 752s 紫外可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司 )； DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）； LRH-250A 型生化培养箱 (广东省医疗器械厂）。 本实验所用丙酮、氯化钠、硫酸镁、甘油等
12、均为分析纯； PN5247 蛋白胨、牛肉浸膏、 酵母粉 等均为生化试剂。 2.1.3 培养基 种子培养基 (g/L)：牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0， NaCl 2.0，琼脂 15， pH 7.4-7.6。 扩大培养基（ g/L）：蛋白胨 13.0，甘油 20.0 .。 Nacl 2.0 摇瓶装 液量 20mL/250mL（ V/V） pH自然。 发酵培养基 (g/L)：蛋白胨 13.0, 甘油 20.0, MgSO4 1.2, NaCl 2.0, Gly 2.0，摇瓶装液量 50 mL/250mL(V/V)，接种量 5 (V/V)， pH 5.7。 2.2 实验方法 2.2.1 种子的培养
13、和优化 种子培养基的配制：按照种子培养基的组成称取牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g， NaCl 2.0g，琼脂15g，放到 1000mL 的烧杯中加水至 1000mL，加热搅拌溶解，用 1mol/L 的 HCl 和 1mol/L 的 NaOH调节培养基的 pH，使其在 7.4-7.614。然后分装在 250mL的摇瓶中，用灭菌锅在 121 下灭菌 20min，最后再倒平板。待平板冷却后在无菌条件下，用接种针挑取甘油管中的菌种划平板，放在生化培养箱中， 37 培养 12h，即得到活化的沙雷氏菌，将其放于冰箱内保存备用。 4 2.2.2 种子的扩大培养 分别称取（ g/L）蛋白胨 13.0、甘
14、油 20.0、 NaCl 2.0 加入烧杯中加水，搅拌，使烧杯中的物料都溶解并分装于 250mL 的摇瓶中，每个摇瓶装 50mL 的培养基，并用灭菌锅在 121下高温蒸汽灭菌 20min，待摇瓶内的培养基冷却后在无菌条件下接种，用接种针挑取平板上的单菌落于摇瓶中。接种完后，液体培养 12h，培养温度为 27 ，转速为 170r/min。 2.2.3 红色素与菌体的提取 转接后放在摇床里培养 48h 后取出，摇匀，分别用移液枪移取 2.00mL 发酵液于 2mL 离心管中， 4 ， 12000r/min，离心 6min，弃上清液，然后用移液枪移取 1mL 的丙酮于各个离心管中，用 100 L枪头
15、搅拌使色素完全溶于丙酮中，再离心，温度为 4 ， 12000r/min，离心 6min。得到灵菌红素丙酮溶液。 2.2.4 灵菌红素含量测定 本实验利用灵菌红素在 535nm 波长下具有最大吸收峰的特性，将提取的灵菌红素丙酮溶液稀释 250倍后于 535nm波长下测量吸光度并利用标准曲线方程计算出发酵液中灵菌红素含量。 2.2.5 灵菌红素吸光度标准曲线测定 称取少量灵菌红素固体，用丙酮溶解后抽滤，去除不溶物后自然干燥至质量不变，制得灵菌红素粗品（下称粗品）。用分析天平准确称量 0.0200g 粗品，定容至 25ml制成 0.8g/L 母液，分别用移液枪吸取 150ul， 200ul， 250
16、ul， 300ul， 350ul 母液于比色管中并用丙 酮定容至 10ml 制成0.012g/L， 0.016 g/L， 0.020 g/L， 0.024 g/L， 0.028 g/L 溶液，分别测量其吸光度值，计算标准曲线，实验平行五次。 2.2.6 单因子实验 实验选取 Pro， Gly， Asp， His， Nacl， MgSO4， MnSO4,蛋白胨，甘油 ，甘露醇 10 个变量，分别进行单因子实验。实验以扩大培养基为基础培养基，分别添加上述物质，各制成不同浓度梯度的实验用培养基，浓度如表 1 所示。接种后置于 28 ， 170rpm 摇床中培养 48h，提取后测量吸光度并换算成浓度，
17、比较各 因子的显著性，实验平行三次。 5 表 2-1 各单因素的浓度梯度 因子 浓度（ g/L） Gly 1.00 1.25 1.5 1.75 2.0 His 0.50 0.75 1.00 1.25 1.5 Pro 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Asp 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 Nacl 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 MgSO4 0.60 0.90 1.20 1.50 1.80 MnSO4 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 蛋白胨 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 甘油 10.00 15.0
18、0 20.00 25.00 30.00 甘露醇 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 2.2.7 PLACKETT-BURMAN 实验 15-18 通过单因素实验后可以了解各个因素对灵菌红素产量的影响，选取其中较重要的 9个因素进一步进行 PLACKETT-BURMAN 实验，观察各因素对发酵的综合影响并选取最显著的因素进一步进行实验。 PLACKETT-BURMAN 实验中各因素及水平见表 2， PLACKETT-BURMAN实验具体实验设计见表 2-2 PLACKETT-BURMAN 实验涉及的因素和水平 因素 水平（ g/L） 代号 名称 低 （ -） 高 （ +）
19、 A Gly 1.00 1.25 B Pro 0.80 1.00 C 空白 1 -1 1 D MgSO4 1.20 1.50 E NaCl 2.00 2.50 F 空白 2 -1 1 G 蛋白胨 12.00 15.00 H His 0.80 1.00 I 空白 3 -1 +1 J 甘露醇 15 25 K 甘油 20 25 6 表 2-3 PLACKETT-BURMAN 实验的设计 处理 Gly Pro 空 1 MgSO4 NaCl 空 2 蛋白胨 His 空 3 甘露醇 甘油 1 - - - + - + + - + + + 2 - + + + - - - + - + + 3 + + - + + + - - - + - 4 + + + - - - + - + + - 5 - - - - - - - - - - - 6 + - + + - + + + - - - 7 + + + - - + - + + - + 8 + - + + + - - - + - + 9 + - - - + - + + - + + 10 - + + - + + + - - - + 11 - + - + + - + + + - - 12 - - + - + + - + + + -
