1、毕业论文 开题报告 生物工程 多酚氧化酶活性测定及控制 一、选题的背景、意义 多酚氧化酶（ PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后， PPO 所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。 本研究就 PPO 的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 二、相关研究的最新成果及动态 2.1 鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化 从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀， DEAE-SepH-Arose 离子交换柱层析以及 PHenyl SepHArose 6FAsT Flow 疏水柱层析进行纯化后，经 SDS-PAGE 电泳确定为单一条带，表
2、明该酶已被纯化到电泳均一。在整个过程中，该酶纯化了 95 66 倍，产率为2 4。同时研究表明，鲜切莲藕组织中 PPO 相对分子质量在 65 900 66 100 之间。 2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较 以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测 PPO活性极显著相关 ,邻苯二酚所测活性强 ,但酪氨酸所测活性的变异系数大。面粉 PPO 活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强 ,但籽粒和全麦粉中的 PPO 活性高 ,变异系数大。 2.3 PPO 活性与小麦粉主要理化指标的 关系 PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性 ,与灰分含量成极显著正相关性 ;前路粉流 PPO活性比后路粉流低 ;物料含皮较
3、多的在线粉流 PPO 活性高 ;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO 活性高。 2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制 在抑制 PPO 活性方面 ,PVP 作用最明显 ,其次是 NA2S2O3、 AGNO3。 2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶 (PPO)活性测定的最佳试验条件 以邻苯二酚为底物时 ,底物浓度宜大于 20mmol/L,其最适波长为 420nm,最适 pH 值为 6.8,最适温度为 50 ,反应时间不 宜超过 20min,反应完成后在 20min 后测定 PPO 的活性最为稳定。抑制剂 NAHSO4 的有效抑制浓度为 0.8mmol/L。 2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶 (
4、PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化 园二色谱分析表明莲藕 PPO 主要含有 一螺旋和 一折叠结构。与抑制剂作用后，莲藕 PPO 活性显著降低，同时伴随其二级结构中 -螺旋结构明显减少，表明莲藕 PPO 的活性中心可能位于 -螺旋结构中。荧光分析表明，莲藕 PPO 与邻苯三酚 (pyroGAllic Acid， PA)作用后，酪氨酸残基荧光强度略有降低，入 mAx位 移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低，入 mAx红移 2 nm；而与莲藕多酚 (LoTus rooT polypHenol， LRP)作用后，莲藕 PPO 分子中酪氨酸 (Tyr)和色氨酸 (Trp)残基荧光强度显著提高
5、，且其最大发射波长分别蓝移 6nm 和红移5nm。当加入异 Vc 钠后， Tyr 和 Trp 残基最大发射峰显著红移，说明 Trp 和防残基位于一定的疏水环境对维持 PPO 催化活性的优势构象至关重要。 2.7 磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响 以邻苯二酚为底物 ,莲藕 PPO 褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促 反应动力学 ,Km 为 0.775mol/L,VmAx 为 11.150U/min。 Vc 对 PPO 有较强的抑制作用 ,反应动力学参数 Km 为 0.081mol/L,VmAx 为 3.243U/min,呈现反竞争性抑制 ,表现为褐变出现滞后 ,随 Vc 浓
6、度的增大滞后时间逐渐增长 ,且呈现 S 型趋势 ,并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下 ,随着处理时间的变化 ,PPO 活性呈现波动性。 3.17A/m 磁场强度下处理 4H 的酶液其反应动力学曲线表现为 S 型 ,并建立了相应的反应方程。 2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响 南湖菱 PPO催化反应 的最适温度为 30 0C ,最适 pH 6.5 ,最佳吸收波长 420 nm ,最大反应速度 VmAx=33.67 uniT/min，米氏常数 Km= 0.286 mol/L。在 3 种抑制剂抗坏血酸、 EDTA 和柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为 0.3 mmol/L
7、。 2.9 二氧化氯 (ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶 (PPO)的影响 100mG L 浓度的 ClO2处理鲜切藕片 5min、 10 min、 15 min 后，在贮藏期间能抑制 PPO的活性，而 10 mG L 浓度对 PPO 的活性不起抑制作用反而促进 了 PPO 的活性 100 mGL ClO2处理鲜切藕片 10 min 抑制 PPO 的活性效果最好。 2.10 底物浓度、 pH、温度对鲜切莲藕中 PPO 酶的影响 鲜切莲藕的 PPO 活性最适反应底物浓度为 0.02 mol/L，并且底物浓度与 PPO 活性的关系完全遵循 MicHeAlis-MenTen 的酶促动力学
8、性质。 PPO 最适 pH 值为 7.O， pH 对 PPO 的影响显著，当 pH4.0 时， PPO 活性显著下降，可见，调节 pH 值可有效地抑制 PPO 活力。 PPO活性的最适温度为 35，在 o -5之间，莲藕的 PPO 活性受到明显的抑制。 2.11 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 添加抑制剂可使莲藕 PPO 反应速率发生变化。苯甲酸 I 可与酶 E 结合生成无活性的二元复合物 EI，减小可供邻苯二酚进攻的游离酶 E 的浓度，也就降低了酶一底物 ES 的浓度，而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率 ymAx，从而破坏了莲藕 PPO 的正常催化氧化反应系统。 2.
9、12 护色处理对多酚氧化酶活性的影响 对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为 EDTA 浓度为 0.25% , Vc 浓度为 0.1%、草酸浓度为 0.25%半胱氨酸浓度为 0.7%、处理时间为 8min。 2.13 气调包装对鲜切莲藕的保鲜效果 采用 8 种不同浓度配比的 O2、 N2和 CO2气体对鲜切莲藕进行包装，置于 4下贮藏，定期测定鲜切莲藕 VC 的含量、多酚氧化酶活性、褐变度以及 pH 值变化，结果显示 100O2组处理的鲜切莲藕，其外观最好，多酚氧化酶活性受到抑制。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 对多酚氧化酶的提取： 匀浆浸提法 （
10、匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入 0 05mol L， pH5 4 的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 (含 5的 PVPP)，料液比为 1： 2 2，捣碎，搅拌， 4。 C 下静置 4H，抽滤，所得滤液即为粗酶液。 3.2 PPO 活性的测定 取浓度 0 05 mol L， pH 值 7 0 的磷酸盐缓冲溶液 1 5 mL 于 1 cm 比色皿中，加入0 1 mol L 的邻苯二酚溶液 1 0 mL， ppo 粗酶液 0 5 mL混匀后在 420 nm 处比色，酶液加入后开始计时，每 30 s 记录 1 次 OD
11、。随时间的变化值，以最初直线段的斜率 ( ODt)计算酶活力一个酶活力单位定义为在测定条件下，每分钟引 起吸光度改变 0 001 所需的酶量 PPO 相对活性 =各处理组吸光度值同组最佳处理组吸光度值 100。 3.3 影响 PPO 活性的因素测定 3.3.1 温度对多酚氧化酶活性的影响 在 l cm 比色皿中，加入浓度为 O 05 mol L， pH 值为 7 0 的磷酸盐缓冲溶液 1 5 mL，0 1 mol L 的邻苯二酚溶液 1 0 mL。在 20“-50 (间隔 5一个处理 )下保温 10 min，加入相同温度下保温 10 mill 的 PPO 粗酶液 0 5 mL。在 30 S 和
12、 l trim。测定 03420 值。 3.3.2 pH 对多 酚氧化酶活性的影响 分别配制 pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的磷酸缓冲液，在 1.2ml 0.2 mol/L 的底物中分别加入上述缓冲液 1.6ml,30 0C 水浴，再加入 0.2 ml 酶液，于 420 nm 处测 OD 值，计算酶活力。 3.3.3 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 (1)方法 1: 抑制剂为抗坏血酸、 EDTA 和柠檬酸 在 1.6 ml 25 mmol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.5),1.2ml 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和 0.2 ml 酶液混合液中加入 0.1 ml 不同浓度的抑制剂
13、，以0.1 ml 蒸馏水代替抑制剂作为对照 .按 1.2.3 节方法测 PPO 活性。 预期结果：抑制剂抗坏血酸、 EDTA 和柠檬酸对南湖菱 PPO 的活性均有一定的抑制能力，且随抑制剂浓度的增大，对 PPO 活性的抑制作用增强，其中，抗坏血酸的抑制效果最好。 （ 2）方法 2：抑制剂为抗坏血酸、亚硫酸钠 用浓度为 0 05 mol L， pH 值为 7 0 的磷酸盐缓冲配制不同浓度的抑制剂溶液在 1 m 的比色皿中，分别加入上述抑制溶液 1 5ml，0 1 mol L 的邻苯二酚溶液 1 0mol， PPO 粗酶液 0 5ml，在室温条件 F 测定 PPO 的活性。 预期结果 ：抗坏血酸和
14、亚硫酸钠对 PPO 的活性有强烈抑制作用，抗坏血酸对 PPO 活性的抑制作用是将酶促反应的中间产物醌还原而抑制褐变；亚硫酸钠对 PPO 活性的抑制作用也是将酶促反应的中间产物醌还原，同时还能与中间产物醌形成稳定的无色物而抑制褐变亚硫酸钠要考虑 SO2，在制品中的残留。 （ 3）方法 3：抑制剂为 ClO2 4冷藏的新鲜莲藕切成薄片，置于不同处理溶液 (ClO2处理浓度 :0.10 mg/L, 50 mG/L,100 mG/L; ClO2处理时间 :5 min,10 min,15 min;处理后样品的贮藏温度 : 4 )中，浸泡不同时间后取出，控干表面水分，以清水处理作对照 (CK)处理的藕片分
15、别装入保鲜袋中置 4下挽口贮藏 10d。每隔 ld 测定相关指标。对照组和处理组均设 3个平行。 预期结果： 100mG/L ClO2处理 l0min 的鲜切莲藕褐变度最小。 （ 4）方法 4：抑制剂为 Vc 取 6 支试管，每支试管加入 0.5 ml 粗酶液、 2 ml 邻苯二酚溶液和 2 ml 磷酸盐缓冲液，并分别加入 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 ml 质量浓度为 0.026 G/L 的 Vc溶液，室温下反应 S min，在波长 420 nm 下每隔 1 min 测定一次吸光度。 预期结果：如图，不同质量浓度的 Vc 对莲藕多酚氧化酶活性有抑制作用，表现为褐变推迟出现，
16、即存在反应滞后期。随着 Vc 质量浓度的增加，滞后时间逐渐延长。（ 5）方法 5：抑制剂为鲜切莲藕保鲜剂组配正交试验 新鲜莲藕切片，按上表对莲藕进行处理，沥干后用 0 04rnm 厚 LDPE 袋真空包装，置于 4“C下贮藏。用清水处理作对照。处理后的莲藕片每隔 l 周测定相关指标，重复 3 次。 预期结果： PP0 活性在鲜切莲藕贮藏期间是呈增加的趋势，经保鲜液处理的样品在贮藏末期仍然能保持在较高水平，保鲜剂的最佳组合 为第 9 组 A383C2D1，即 0.3 L-Cys+0.5Ca+0. Vc 十 0.5 NaCl。 （ 6）方法 6：抑制剂为 NAHSO3 和硫脲对石榴 PPO 活性的
17、影响 配制 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8 mol/ L 的 NAHS03和硫脲溶液，加入反应体系（包括石榴 PPO 提取液 2ml,0.1mol/L 的儿茶酚 1ml、不同 pH 的缓冲液 2ml），以加入 20%TGA 2ml 反应液为对照，测定吸光度值，作出吸光度 -抑制剂浓度曲线，以确定适宜的抑制剂浓度。 预期结果：反应液中抑制剂 NAHSO3浓度达 0.2mmol/ L时酶活下降了 63.4%;浓度为 0. 4 mmol/ L 可 100%抑制酶活。而硫脲对石榴 PPO 活性的抑制作用不明显，当浓度达到 0. 8mmo1/ L 时，抑制率仅为 9. 76%。 （ 7）方
18、法 7：抑制剂为气调包装 取出预冷后的莲藕，洗净去皮，切分为 0 5cm 左右的薄片，立即进行气调包装。包装气体按不同的初始气体比例分为第一组 5 O2+15 CO：+80 N2，第二组 15 O2+5 CO2+80 N2，第三组 10 O2+10 CO2+80 N2，第四组 20O2+60 CO2+20 N2，第五组 100 O2，第六组 100 CO2，第七组 100 N2。为了进行分析比较，第八组采用空气包装作为对照组。每组包装七个样品，每个样品重约 200G。包装后立刻转移至 4、相对湿度为 85左右的恒温培养箱中贮藏。 预期结果：鲜切莲藕多酚氧化酶活性随贮藏时间的延长呈现不同的变化趋
19、势。第四、六、七及对照组的多酚氧化酶活性在第 6 8d 达到最高后呈现下降趋势，而第一、二、三、五组的多酚氧化酶活性呈现缓慢上升趋势。 （ 8）方法 8：分别配制 0.15 G ml 的异 Vc 钠溶液， 0.2 G L 的 CACl2， 0.15 G L 的半胱氨酸溶液， 0.15 G L 的柠檬酸溶液， 0.15 G L EDTA 溶液及 0.3 mG ml 的莲藕 PPO溶液，混合后测定酶活性。 预期结果：异 Vc 钠对莲藕 PPO 有较强的抑制作用，抑制率为 96 2，其次为半胱氨酸、氯化钙、柠檬酸， EDTA 的抑制效果最低。 （ 9）方法 9：将已经切片的莲藕放入 2%NACl+0
20、.2%NA2S03溶液，护色 l0min，然后取出清洗干表面水分；选择 EDTA（ A）、 Vc（ B）草酸 (C)、半胱氨酸 (D)和处理时间 (E)为参试囚子，采用 L16(45正交试验方案，如图： 预期结果：如下图， 随着贮藏时间的延长，鲜切莲藕多酚氧化酶活性在贮藏期的前期呈上升趋势，并在第 9 天达到峰值，其后活性又逐渐下降。 四、论文详细工作进度和安排 2010.11.22 学生选题 2010.11.26 布置论文任务 2010.11.28 2011.3.15 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备论文实验所需基本材料 2010.12.15 完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译 201
21、1.3.15 前 在学校指定时间完成开题答辩 2011.3.15 2011.5.12 实验 2011.5.17 完成并提交毕业论文 2011.5.31 在学校指定时间进行毕业论文答辩 2011.6.5 完成并提交答辩后的修改论文 五、主要参考文献 1 潘永贵 ,陈维信 .鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化 . 食品与生物技术学报 ,2008,27(2):55-59 2 姚显伟，郭祯祥，马洪娟，张杏丽 .在线粉流中小麦多酚氧化酶活性分析 .粮食与饲料工业， 2010,（ 5）： 4-6 3 张晓 ,田纪春 . 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较 .山东农业人学学报 (自然科学版 ), 2008
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