1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 甘草多糖提取过程中除蛋白方法的比较研究 1 选题的背景和意义 甘草 (Glycyrrhiza)是多年生草本植物，属豆科甘草属。作为中药甘草指的是甘草属部分植物的根及根茎。我国作为药用而收载的甘草主要有乌拉尔甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch )、胀果甘草 (Glycyrrhizainflata Batal)和光果甘草 (aycyrrhiza glabra L)。甘草是一味应用极其广泛的中药，这与甘草中的有效成分有关。 广泛存在于各种动植物和微生物组织中 的多糖，是由各种单糖组成的天然高分子化合物。除典型的纤维素和几丁质外，各种类型
2、的纤维素、果胶、粘液质都具有结构多糖的功能。从二十世纪六十年代后，多糖所具有的各种生理功能逐渐为人们所重视，尤其是增强免疫力的功能被广泛认同，并被广泛应用于肿瘤化疗等。目前世界各国，尤其是美国、日本等发达国家正投入大量人力、财力对各种动植物、微生物多糖进行深入研究。但天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分共存，且两种物质分子量相近，另外糖常常与蛋白形成糖蛋白复合物，使蛋白质的脱除变得更加困难。但也许正是由于结合了这部分蛋白质，多糖才 具有众多独特的生理功能。 另据报道甘草中的多糖有降血糖 、抑瘤作用 等多种功能：可是在提取甘草多糖时，提取物中蛋白质含量很高，这对纯化带来了很大困难。本文针对甘草多
3、糖水提物中蛋白质含量高这一情况，对几种甘草多糖脱蛋白方法进行了对比研究，以确定最佳脱蛋白。 2 相关研究的最新成果及动态 对于甘草多糖的药理研究刚刚起步，主要在抗病毒、抗肿瘤、提高免疫功能等方面。 甘草多糖是近年来我国学者从中药甘草中提取出的活性中药多糖，具有一定的抑瘤作用。通过建立好的 Balb/c荷瘤小鼠模型进行动物试验，计算抑癌率是比较直接准确 的观察甘草多糖抑瘤作用的方法。给予甘草多糖处理过的小鼠的肿瘤明显缩小，且轻于只给予生理盐水的对照组小鼠，二者具有统计学上显著差异，这与相关文献报道一致。 用甘草多糖 （ GPS） 作为抗病毒制剂 ， 检测其抗牛艾滋病病毒 、 腺病毒 、 柯萨奇病
4、毒。2 多糖是一种重要的生物高分子化合物 ， 作为生物效应调节剂可影响机体免疫功能 力 而起到抗炎 、 抗病作用 。 结果表明 GPS 对三种病毒均有较明显的拮抗作用 ， 对艾滋病病毒的抑制率为 36.2%可影响病毒合胞体形成 达到保护细胞作用 ， 还可影响腺病毒和柯萨奇病毒的吸附及进入细胞的功能 ， 达到保护细胞作用 。 其保护率分别为 74.9%和 59.0%因此可认为 GPS可吸附于细胞表面或进入细胞内 ， 以防止病毒的吸附和进入 ， 可适用于预防病毒感染和治疗 。 另外，李晓冰 ; 何小鹃等建立 H22 荷瘤小鼠模型 ,观察甘草多糖对模型小鼠脾脏调节性T 细胞及脾淋巴细胞转化率的影响
5、,探讨甘草多糖的免疫调节机制结果 :模型组小鼠 Treg 细胞比例明显高于正常组 ,甘草多糖组 Treg 细胞比例低于模型组 (P0.01),甘草多糖组脾淋巴细胞转化率明显高于环磷酰胺组。甘草多糖与环磷酰胺无交互作用。结论 :甘草多糖可能通过降低荷瘤小鼠 Treg 细胞的比例及提高脾 淋巴细胞转化率而发挥抗肿瘤免疫调节作用。 陆清儿 ; 童朝明等研究了甘草多糖的广泛用途及抑菌效果试验方法与试验过程。 结果表明 :甘草多糖成品对大肠杆菌的最低抑菌浓度 (MIC)和最低杀菌浓度 (MBC)均为 16 万 mg/L;对金黄色葡萄球菌的 MIC和 MBC均为 10万 mg/L;其纯品对大肠杆菌的 MI
6、C和 MBC均为 4万 mg/L、对金黄葡萄球菌的 MIC和 MBC均为 2万 mg/L;纯品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为 5mm 和 8mm 。程安玮 ; 金征宇等通过研究甘草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞 NO、 iNOS 的生成及 iNOSmRNA 表达的影响 ,结果表明 :GP 能剂量依赖性地增加活化的巨噬细胞中 NO 的生成量及 iNOS 的活性 ,当 GP 的添加浓度为 400 g/ml 时 ,NO、 iNOS 的分泌量和 iNOSmRNA 表达达到最大。固定 GP 添加量为 100 g/ml,培养时间在 48h 时 ,NO、 iNOS 的分泌量和 iNOSmRNA表达量最大。
7、这表明 GP 刺激巨噬细胞 NO 合成的调节可发生在 iNOS 的转录水平 ,从而刺激巨噬细胞 NO 大量合成与释放 ,GP 的免疫调节作用和抗肿瘤作用机制可能与 GP 刺激巨噬细胞iNOS 从头合成从而增加 NO 生成有关。 3 课题的研究内容及 拟采取的研究方法、研究难点及预期达到的目标 3.1 课题研究内容 1、 甘草多糖 提取方法的确定 （在老师指导下，并通过查找文献资料，最终确定了最佳制备粗多糖的实验条件。） 2、粗多糖 除蛋白方法的比较研究 （对 1 制备的粗多糖进行三种除蛋白试验，比较分析找出最佳的除蛋白方法） 3.2 拟采取的 研究方法 1、超声波法辅助提取甘草多糖：甘草饮片
8、粉碎 超声波提取三次 过滤 滤液浓缩3 乙醇沉淀 过滤得沉淀 无水乙醇，丙酮，乙醚分别洗涤三次 干燥 粗多糖产品 2、 Sevag 法 : 取一定粗多糖热水溶解 过滤 定容一定体积 加入 Sevag 有机溶剂，震荡脱蛋白，重复多次操作 每次取一定体积上清液 加 95%的乙醇至含醇量达 80%，离心，收集沉淀 依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤三次沉淀 干燥 Sevag 法 甘草 多糖 I， II， III。 3、胰蛋白酶法 : 取一定粗多糖热水溶解 过滤 定容一定体积 加入胰蛋白酶脱蛋白，重复多次操作 灭酶 每次取一定体积上清液 加 95%的乙醇至含醇量达 80%，离心，收集沉淀 依次用无水乙醇，
9、丙酮，乙醚洗涤三次沉淀 干燥 胰蛋白酶法 多糖 I， II， III。 4、三氯乙酸法 : 取一定粗多糖热水溶解 过滤 定容一定体积 加入 40%三氯乙酸溶液脱蛋白，重复多次操作 每次取一定体积上清液 加 95%的乙醇至含醇量达 80%，离心，收集沉淀 依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤三次沉淀 干燥 三氯乙酸法多糖 I， II， III。 5、多糖含量测定采用苯酚硫酸法，蛋白质测定采用考马斯亮兰法进行 3.3 研究难点 1、多糖和蛋白测定方法的稳定性不是很好，要求操作条件较苛刻； 2、提取粗多糖的前处理比较麻烦，处理不当可能影响蛋白去除。 3.4 预期目标 优化出一条蛋白去除率高、多糖损失率低，
10、同时可操作性强的工业化生产 甘草多糖 的工艺路线。 4 论文详 细工作进度和安排 2010.11.4 2011.3.15 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备论文实验所需基本材料 2010.12.15 完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译 2011.3.15 前 在学校指定时间完成开题答辩 2011.3.15 2011.5.12 实验 2011.5.17 完成并提交毕业论文 2011.5.31 在学校指定时间进行毕业论文答辩 2011.6.5 完成并提交答辩后的修改论文 5 参考文献 1 Kim Y， Park H.W， Kim J H.， et a1 Anti-canoer effect a
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