1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化 1 选题的背景和意义 淀粉酶在工业酶制剂生产中占有十分重要的地位，广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业，居市场份额第一。但是，我国的 -淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一， -淀粉酶活也较国外同行业低 1。淀粉酶的生产主要依靠微生物发酵。而近年来，尽管转导转化和基因克隆等分子生物技术已经广泛应用，但是这些方法成本较高，目前投入商业化生产的 -淀粉酶生产菌株几乎都是通过从自然界中分离得到的野生型菌株 1。因 此不断从自然界中分离淀粉酶产生菌，并探索其最佳发酵条件有重要意义。 本次实验从自然界中分离产
2、淀粉酶的菌株，通过测定酶活筛选出产酶量较高的菌株，利用液体发酵法对其产 -淀粉酶培养基配方进行优化，获得在生产应用方面具有一定优势的 -淀粉酶产生菌以及其较优的培养基配方，以适应工业生产需求。 2 相关研究的最新成果及动态 在菌种筛选方面，一般是采用碘比色法或者 DNS 比色法，测定淀粉酶酶活 3-5。即通过测定淀粉酶水解的淀粉的量，或者生成的麦芽糖的量来测定其相应酶活。上面有种方法虽然原理上有所不同，但实际操作上较 为相似。而且由于其试剂配制方便，操作简单，灵敏度高，故在国内广泛应用。而在临床医学领域应用较为广泛的试剂盒法 6，由于其价格昂贵，一般不做为生物实验室的检查手段。 在培养基配制优
3、化上，由于 数学统计以及计算机技术的发展，统计学中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中，其中以响应面方法的效果最为显著7。响应面方法 (Response Surface Methodology,简称 RSM)是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通 过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。由于该方法试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用，故近年来广泛应用于各种培养基的优化上。 RSM 在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决
4、生产过程中的实际问题的一种效方法。 8 2 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法、研究难点及预期达到的目标 3.1 课题研究内容 高性能淀粉酶菌株的筛选及其培养基优化。 3.2 研究方法 初筛：以淀粉为唯一碳源，比较碘液水解圈直径与菌落直径比值（ D/d） 复筛：将初筛得到的菌株摇瓶发酵，通过 DNS 法或者碘比色法测定酶活，比较其单位体积发酵效率。 培养基成分优化：通过单次因子法，考察培养基组分中各因子对淀粉酶生产的影响和规律。利用 Placket t-Burman 实验设计方法、响应面分析对培养基中主影响因子进行优化，并建立起培养基主因子和淀粉酶生产能力的相应数学模型。 查阅相关文献 采样
5、（土壤） 含淀粉有机物 产酶能力检测 （ DNS 法或者碘比色法） 复筛 初筛 比较水解圈直径 /菌落直径大小 菌种筛选 Placket t-Burman 实验设计 单次因子法 培养基优化 响应面分析 验证试验 3 3.3 研究难点 筛选和培养基优化试验都是很大的工作量。筛选要经过初筛复筛，以及多次的重复。在筛选到满 意的菌株前，培养基优化等工作是无法进行的。而在培养基优化的时，由于单因素实验、 Placket t-Burman 实验以及最终的响应面分析，都需要在大量的摇瓶发酵相关酶活数据的基础上。若实验测定的数据不符合软件要求，则又必须修改方案，重新测定 9。 前期培养基的配制比较重要，不合
6、理的培养基可能会导致产酶能力的下降。如在筛选时，一般是配制以淀粉为唯一碳源的鉴别培养基，但由于淀粉不是速效碳源，培养基相对贫乏，则可能产酶菌株不产淀粉酶或者酶活很低 10。而且菌株在不同的生长条件下，所表现的生物状态是不一样的。 因 此，在前期查阅文献时，应确定若干的培养基配方，并做测试实验，选择适合的培养基，以减少不必要的重复实验或者漏筛 11。 3.4 预期目标 获得在生产应用方面有一定优势的淀粉酶产生菌。 获得其摇瓶发酵（初试阶段）的最优培养基配方，并估计其酶活。 4 论文详细工作进度和安排 2011.2.16 2011.3.12 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备论文实验所需基本材料
7、2011.3.10 前 完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译 2011.3.12 前 在学校指定时间完成开题答辩 2011.3.12 2011.5.10 实验 2011.5.10 完成并提交毕业论文 2011.5.31 在学校指定时间进行毕业论文答辩 2011.6.5 完成并提交答辩后的修改论文 5 参考文献 1 杨自鹏 ,张金辉 ,苏静 .一株黑曲霉所产 -淀粉酶的提取及其特性研究 J.河南职工医学院学报 ,2006,18(6):431 2 刘赵玲 ,李文婷 ,毛芝娟 .一株 -淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化 J.浙江万里学院学报 ,2010,23(5):83-89 3 赵凯 ,许
8、鹏举 ,谷广烨 .3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究 J.食品科学 ,2008(8):534-536 4 4 方芳 ,曹建明 ,袁谦 .淀粉酶测定用碘标准液新的配制方法 .临床检验杂志 ,2001,19(6):380 5 宋燕 ,李津 .一株碱性 -淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 J.食品与药品 ,2010,12(05)：167-170 6 张连祥 ,刘晨梅 ,蔡忠 ,王兆成 .七种试剂盒检测 -淀粉酶结果的比较及分析 .临床论丛 , 2002,30(9):554-555 7 慕运动 .响应面方法及其在食品工业中的应用 J. 郑州工程学院学报 ,2001,22(3)： 91-94
9、. 8 褚以文 .微生物培养基优化方法及其 OPTI 优化软件 J. 国外医药抗生素分册 ,1999,20（ 20）： 58-61 9 安弋 ,刘新育 ,芦鹏 ,刘亮伟 ,陈红歌 .1 株酸性 -淀粉酶产生菌的鉴定及发酵条件优化 J.安徽农业科学 ,2010,38(4):1709-1711 10 OIEG N R,CHRISTINA D,JOHANM,el a1 Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of somem bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilisJ.FEMS Mierobioogy Ecology,2004,48:249-259 11 陆雯 ,刘杰 ,雄刁萍 ,陈号 ,朱丽云 .枯草芽孢杆菌产淀粉酶培养条件的优化研究 J.中国食品工业 ,2010,1:52-53
