1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 高 性能 淀粉酶菌株的筛选 1 选题的背景和意义 淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，在淀粉糖工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒行业中被广泛应用。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一 1、 2。 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。根据淀粉酶水解淀粉的作用方式可分为-淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。 -淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三 糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为 构型，同时该酶能使
2、淀粉浆的粘度下降，又称为液化酶； -淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，又被称为糖化酶，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为 构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解 -l， 4 糖苷键和分支的 -1， 6-糖苷键，生成葡萄糖。异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的 -1， 6-糖苷键，切下侧枝链 3。 淀粉酶是工业中最重要的酶。如今，在生物制药领域，它也具有重要的作用。虽然淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶 ，特别是 -淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。应
3、用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用 -淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也应该开发具有有效 -淀粉酶活性的菌株， -淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。在 工业上的作用，淀粉酶的耐热性已成为非常重要的性质，因此，我们也应该努力从耐热和极端耐热的微生物中生产淀粉酶。另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。 2 2 相关研究的最新成果及动态 2.1 -淀粉酶的催化机理 目前公认的
4、-淀粉酶的催化机理 4，催化中心位于 / 桶状结构的底部， 261 位谷氨酸和 231 位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体 261 谷氨酸质子化；第二步，亲核基团 231 位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的 C1，糖苷键 断裂，葡萄糖残基与 231 位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的261 位谷氨酸夺取一个水分子 H+，产生一个 OH-；第三步， OH- 攻击葡萄糖残基的 C1，使酯键断裂， 261 位谷氨酸和 231 位天冬氨酸重新恢复初始状态。在已知结构的 -淀粉酶中，在 /桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相
5、对位置相似，并且所有 -淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的 4、 5。以对 -淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生 产中应用是近年来新兴的发展趋势。 2.2 -淀粉酶的突变研究 目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。随机突变首先需构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法。它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。将这些方法应用于 -淀粉酶的
6、研究已有一定进展。目前有关突变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如 Takase研究发现天冬酰胺 326 赖氨酸 /天冬氨 酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌的 pH 特性。 Nielsen J E 等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺 264 丝氨酸和天冬酰胺 190 苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性。 Shaw A 等通过随机突变，得到 Met15Thr,能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现 Met15Thr 和天冬酰胺188 丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高 2 倍 6。但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变说法不一，还有待进一步研究。
7、 2.3 基因克隆及氨基酸序列 分子生物技术的发展，对 -淀粉酶的 研究已进入分子水平阶段，在 -淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，3 基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的 -淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。 Suganum a et al. 研究了 -淀粉酶的N-端氨基酸序列。 Kim et al. 描述了编码一种新 -淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达 7。 Steyn 和 Pretorius 编码 -淀粉酶基因 (AMY)编码 GA 的基因 (STA 2)转入一
8、个酵母菌的整合载体 (Yip5)，形成重组质粒 pSP1 和 pSP2， AMY 和 STA 2 被一同连接到载体 Yip5 中，产生质粒 pSP3。随后，编码抗 Geneticin 418 显性标记的 A PH 1 被克隆到 pSP3 中得到 pSP4。为了增强 Geneticin 418 的表达， pSP4 再连接启动子 GAL10 和终止子 URA3，这样就得到质粒 pSP5。 pSP5 通过增加 ARS1H 和 CEN4 序列被修改成环形微染色体 pSP6。转入了pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种 -淀粉酶和 GA 7。 3 课题的 研究内容及拟采取的研究方法（技术路
9、线）、难点及预期达到的目标 本课题希望通过对曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌的比较，筛选获得淀粉酶活力较高及生产性能较好的菌株 1株，对其产酶条件及酶学性质进行研究。实验具体内容包括： (1)产淀粉酶菌株的筛选； (2)产酶菌株的鉴定； (3)菌株发酵条件的优化； (4)酶学特性的研究。 曲和其他不同来源的淀粉酶产 生菌 初筛 4、 5 株淀粉酶高产菌 复筛 1、 2 株淀粉酶高产菌 菌种鉴定 菌种保存 发酵的培养基优化 酶学性质研究 平板涂布分离法 平板划线分离法 试管斜面保存 响应面法优化温淀粉酶发酵条件 酶的稳定性 酶最适反应 酶活性测定 4 3.1 产酶菌株的筛选流程图（如上） 3.2
10、菌种来源 曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌。 3.3 培养基 采用淀粉固体培养基分离培养。称取牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、 NaCl 5g、可溶性淀粉 2g溶于 900mL 蒸馏水中，再加入 25g 琼脂粉并搅拌至充分溶解，调 pH 至 中性 ，最后加蒸馏水定容至 1000mL，高压蒸汽灭菌 2。 3.4 初筛方法 称取 酒曲 5g，倒入盛有无菌水带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡 后 制成土壤悬液记为 10-1土壤稀释液。用无菌移液管吸取 10-1 的土壤悬液 0.5 mL，放入 4.5 mL 无菌水中吹吸数次混匀即为 10-2 稀释液，照此分别制成 10-2 10-9 的稀释液，分别取 10-7
11、、 10-8、 10-9 土壤稀释液各 0.5 mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种 到数个 平板，恒温培养，待长出菌落后，滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，进行斜面培养，作为初筛菌株编号保藏 8。 3.5 复筛方法 把初筛出的菌株划线到 不同编号的 平板培养基上， 恒温培养一段时间 ，长出单菌落后，选择直径 相当 的单菌落，滴加卢戈氏碘液，用游标卡尺测水解圈直径，选取水解圈直径相对较大的菌株作为复筛菌株即实验菌株，进行菌种鉴定及产酶条件优化 9。 3.6 细菌鉴定 参照伯杰细菌鉴定手册 ,鉴定项目包括：形 态观察、革兰氏染色、芽孢染色、糖发酵、 V-P 试验、淀粉水解、
12、木糖产酸、柠檬酸盐试验及耐盐性试验等 10。 3.7 响应面法优化温淀粉酶发酵条件 在优化初期利用 Plackett-Burman（简称 PB）设计法，将初始发酵培养基的 8 种成分：可溶性淀粉（ X1）、尿素（ X2）、 K2HPO4（ X3）、 KH2PO4（ X4）、 MnSO4H 2O（ X5）、 MgSO47H2O（ X6）、豆粕（ X7）和酵母膏（ X8），分别作为 PB 试验设计的 8 个因素，每个因素取 2 3个水平，即低水平（ -1）为初始发酵培养基各成分的浓度，高水 平（ +1）取低水平的 1.5 倍。活菌含量作为响应值 Y11、 13。 根据 PB 试验筛选出的对发酵液活
13、菌含量影响显著的因素、以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径，快速的逼近最大响应区域。 Box-behnken 设计 Box-behnken 设计适用于 2 5 个因素的优化试验，基于 PB 试验设5 计和最陡爬坡试验的试验结果，进行 Box-Behnken 设计：以 PB 试验筛选得到的对发酵液活菌含量影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据相应的试验表进行试验后 11，使用 SAS 对试验结果进行响应面分析 12。 3.8 酶学特性研究 3.8.1 酶活测定 淀粉酶酶活定义： 1 mL 酶液（或 1g 固体酶粉）在 pH 6.0，温度 60 ， 1min
14、液化可溶性淀粉 1mg 所需的酶量称为一个酶活单位（ U）。测定： 2 %可溶性淀粉溶液 10mL， pH6.0磷酸二氢钠 磷酸氢二钠缓冲液 2.5mL 于 60 下水浴预热 5min 后，加入稀释一定倍数的酶液 0.5mL 反应 5min，用 0.1mol/L 的盐酸 0.5mL 终止反应。取 1mL 反应液于 5mL 比色碘液中，用比色碘液做空白样，测其 660nm 吸光度 A660。根据 A660 与酶浓度 C 的回归方程式计算出 C。酶活力 =C稀释倍数 16.714。 3.8.2 酶的性质分析 15 （ 1）酶反应的最适温度：将酶溶于 pH 4.0 的磷酸缓冲液中，在 4 100 范
15、围内，不同温度下测定酶活性，以最高酶活力为 100%，计算相对酶活力； (2)酶反应的最适 pH：将酶溶于范围在 2.6 7.6 之间，不同 pH 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，于最适反应温度下测定酶活力。以最高酶活力为 100%，计算相对酶活力； （ 3）酶的热稳定性：将酶溶于 pH4.0 的磷酸缓冲液中，在不同温度下处理不同 时间后冷却，分别测定酶活力，以未经热处理的酶所测得的活力为 100%，计算相对酶活力； （ 4）酶的酸稳定性：将酶溶于范围在 2.6 7.6 之间，不同 pH 的磷酸缓冲液中，在 37 下放置不同时间后，测定酶活力。以未放置于 4 下保存的酶所测得的活力为 100%，计
16、算相对酶活力 ; （ 5）酶的 Km 值测定：以可溶性淀粉为底物，在 pH 4.0， 60 的条件下以不同浓度 (S)的可溶性淀粉为底物溶液 ,测定酶的反应速度 V(以单位时间内吸光度的减少量 dA/dt 来表示 )，以 1/V21/S的双倒数法作图，计算 Km 值； （ 6）金属离子对酶活性的影响 16、 17：分别配置含有 5mmol/L 的不同金属离子的等量酶液，充分混匀后，在 适当温度下 下放置 一段时间 后， pH4.0 条件下测定酶活力。以未含金属离子的酶活力为 100%,计算相对酶活力。 3.9 重点难点 高活力淀粉酶菌株的筛选；淀粉酶的酶学性质研究。 6 4 论文工作进度和安排
17、 2010.10.30 选题 2010.11.5 布置论文任务 2010.11.5 2010.12.30 查阅文献资料，翻译英文文献，完成文献综述和开题报告 2011.1.10 文献综述、开题报告和翻译文章定稿并上交 2010.11.5-2011.1.10 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备实验所需基本材料 2011.4 月前 在学校指定时间完成开题答辩 2010.11.5 2011.5.12 毕业论文实验阶段 2011.5.13 完成并提交毕业论文 2011.5 在学校指定时间进行毕业论文答辩 2011.6 完成并提交答辩后的修改论文 5 参考文献 1 孙晓菲 ,李爱江 .-淀粉酶的应用及研
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