1、毕业论文 开题报告 生物工程 高效液相色谱测量发酵液中灵菌红素含量 一、 选题的背景、意义 灵菌红素 (prodigiosins)是一类天然红色素，具有吡咯环结构，主要包括 prodigiosin、nonylprodigiosin、 cylononylprodiginine和 metacycloprodigiosin等。灵菌红素均具有一定的免疫活性，如抑制真菌、细菌和霉菌等功效，且具有一定的抗肿瘤作用，因此具有很大的药用价值，受到科研工作者的极大关注 1,2。同时，由于其天然红色素的特性，在 作为食品添加剂 时 具有较高的安全 性 ， 无毒、色泽亮丽诱人 等优势 ， 倍受人们的瞩目 1。 高效
2、液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点： 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 高效：分离效能高。 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 高灵敏度：紫外检测器可达 0.01ng，进样量在 uL数量级。 应
3、用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在 1530分钟，有些样品甚至在 5分钟内即可完成，一般小于 1小时。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点 灵菌红素对医学、食品方面有 巨大的作业，但目前利用高效液相色谱法测量发酵液中的灵菌红素的报道非常少，因此研究高效液相色谱法测量发酵液中的灵菌红素是一条非常有应用前景的测量方法。本实验通过测量发酵液中的灵菌红素来确定一条利用高效液相色谱法测量其含量的有效方法。 二、
4、 相关研究的最新成果及动态 2.1 HPLC 在医学中的应用 2 2.1.1 HPLC 测血药浓度 临床上应用的一些药物由于其有效血药浓度范围狭窄，个体差异大，且不同厂家产品存在生物利用度差异，其血药浓度与药效和毒性密切相关，在治疗过程中需要常规监测其血药浓度。沈建幸等 3建立以 高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英、卡马西平血药浓度的方法，方法为取患者血清经二氯甲烷提取后在 C18柱上分析，流动相为甲醇一水 (54： 43)，柱温为 30C ，检测波长为 254nm，流速为 0.8ml min。结果表明此方法简便稳定，用于苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度监测效果良好。此外测定一些药物的
5、血药浓度可研究该药在人体的药代动力学及药效学赵丽等 4用 HPLC 法测定八血浆中的普鲁卡因，于仁娈等 5用 HPLC 法测定盐酸二甲双胍的血药浓度，结果都表明该方法准确、简便、专属性强、灵敏度高，适用于临床药 代动力学及药效学研究。 2.1.2 测定中药中的有效成分 由于中药药物成分复杂，所以需要建立有效、准确的方法测定中成药有效成分的含量，以控制产品质量。马开等 6用 HPLC 测定痛可停胶囊中欧前胡索和异欧前胡索含量，结果显示该法测定的欧前削素和异欧前胡索分别在 60325g 和 50250g 范围内与峰面积呈线性关系，平均回收率分别为 98.3和 98.7， RSD 分别为 1.73和
6、 1.65，表明该法可作为痛可停胶囊的含量测定方法。曾海静等 7为了有效控制复方葛根合剂质量，测定其有效成分葛根索含量，研究采用 HPLC 法测定其中葛根索含量，结果表明此方法操作简便，结果准确可靠，精密度好，可用于复方葛根合剂中葛根索的含量测定。 2.2 高效液相色谱在食品分析中的应用 8 2.2.1 蛋白质与氨基酸的分析 910 蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链，相对分子质量大，在溶液中的扩散系数小，粘度大，易发生变性，这使他们的色谱分离情况不理想，因此蛋白质的分离和分析问题至今仍是具有挑战性的课题。 Mar Am.Yust11等用反向高效液相色谱法检测饲料
7、中的色氨酸。其加权回收率为98.6 100。与其他的分析色氨酸的方法相比，反向高效液相色谱法在检测时间上有所减少。李东等以 HyperilODS C18 色谱柱， 2， 4 一二硝基氟苯为衍生化试剂，梯度洗脱。结果表明所测氨基酸组分的浓度在 0 2mg/L 0l3mg/L 范围内与峰面积之间具有良好的线性关系，回收率为 90.4 101.0，检出限为 0 12mg/L 1 225mg/L，测定结果的相对标准差为 1.05 5.93。陈春晓等采用高效液相色谱仪带全自动衍生功能的的自动进样器进行在线衍生，经梯度分离，再利用二极管陈列 -荧光检测器串联分析。测 定结果表明， 17种氨基酸分离良好，线
8、性范围为 10 mol/L 1000 mol/L，相关系数在 0.9988 0.9999 之间，所测液体样品回收率为 90 97。 2.2.1 维生素的测定 维生素是人体内代谢过程中起重要作用的物质，维生素种类很多，化学结构上并无共性，它们可以分为胺类，醛类或醇类。 李克 12等采用离子对反向高效液相色谱法同时测定了复合维生素片中烟酰胺、维生素B1、维生素 B2、维生素 B6等 4 种水溶性维生素的含量。以 Hy-persil C18化学键合硅胶为固定相，紫外检测器于 280nm 波长下检 测。该方法已成功应用于复合维生素片中 4 种水溶性维生素的同时测定。 成志强 13等建立了以 0.05m
9、ol LKH2PO4 一甲醇为流动相的梯度洗脱反向高效液相色谱同时测定维生素 C、 B1、 B2、 B6、 B12、烟酸、烟酰胺和叶酸的分析方法。方法检出限为 1.40.76ng，用该法测定了奶粉、玉米粉、饮料及复合维生素片中的水溶性维生素，相对标准偏差 2.8 8.8；加标回收率 74.7一 112.5。 2.3 高效液相色谱在环境监测中的应用 14 2.3.1 张梅凤 15应用高效液相色谱技术对生物样品农药残留进行了 分析研究 色谱条件 :色谱柱 :416x25mmC18 柱，柱温 :30 ，流动相 :乙腈 :水 (35:65)，流速210ml/min，检测器 :紫外检测器，灵敏度 010
10、1 AUFS，根据各组分设定合适的波长时间程序 .称取 510g 试样于 50ml 离心管中，加入苯 10ml，无水硫酸钠 6g，匀浆 3min。将离心管放入离心机中以 2500 转 /min 离心 5min。用吸管将上清液转入 20ml 离心管中。残渣再用 2 5ml苯提取两次，合并提取液并于 50水浴上用氮气吹干。离心管冷却至室温，用 5ml 乙酸乙醋将残渣洗入层析柱中，以 2ml/min 的流速使溶液流出并弃去。用 15ml 洗脱液洗脱组分。洗脱液于 50水浴上真空蒸干，用 110ml 流动相溶解残渣，取上清液进样。 2.3.2 崔莹 16应用高效液相色谱技术对环境中的磷脂进行了分析研究
11、 用 silica 硅胶柱为固定相，也有用 CN 氰基柱、 NH2 氨基柱和 DIOL 二醉柱的报。流动相有氯仿一甲醇一氨水、正己烷一异丙醉一水以及乙睛一甲醇一水，在流动相中加入离子抑制剂如 85%磷酸、乙酸馁、 30%氨水、乙酸，可以有效改善峰形，抑制色谱峰拖尾磷脂在正相色谱中的分离是由于各组分分子极性大小不同，流出顺序不同，各组分 得到分离。如硅胶住上 .正己烷一异丙醉一水为流动相时， PE 极性最小， PC 极性最大， PI 位于中间，故一般的流出顺序为 :PE、 Pl、 PC，当甲醇一乙腑一磷酸为流动相洗脱时略有差别，流出顺序为 PI、PE、 PC。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方
12、法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容 ： 本课题所要研究的是 要建立一种快速方便的准确测量灵菌红素含量的液相色谱方法，能准确测量各种灵菌红素产品中灵菌红素的含量，并进一步结合灵菌红素的生产发酵过程，测量发酵体系中产品含量，监测生产过程。 3.2 采取的研究方法、技术 路线 ： 在一般液相色谱测量物质含量的方法基础上，对测量灵菌红素含量的色谱方法进行优 化，开发建立一种快速准确测量各种体系中灵菌红素含量的液相色谱方法。 3.3 课题的研究难点 ： 高效液相色谱测量发酵液中灵菌红素含量 时影响测量结果的各种因素，并从中筛选出主要因素，尽量得到最准确的效果。 3.4 预期达到的目标
13、 ： 找到 一种快速方便的准确测量灵菌红素含量的液相色谱方法，能准确测量各种灵菌红素产品中灵菌红素的含量 。 四、论文详细工作进度和安排 2010 年 11 月 28 日 -11 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 2010 年 11 月 1 日 -2011 年 1 月 9 日： 继续查阅文献资料， 翻译外文资料、文献综述和开题报告的撰写 。 2011 年 3 月： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 -5 月： 毕业论文实验工作 。 2011 年 5 月 2011 年 6 月通过实验得到的数据及资料，撰写毕业论文，交由指导老师审核，准备毕业论文的答辩。 2011 年 6 月： 完成
14、毕业论文答辩。 五、主要参考文献 1 刘同军 , 杨海龙 , 唐华 . 灵菌红素的研究进展 . 食品与药品 J. 2007, 8(9): 47-51 2刘慧明 .高效液相色谱技术及其在药物分析中的应 用 J. 中国现代医生 .2007(11):155-156 3沈建幸，陈均良高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度 J.中国药房 2004， 15(4)： 97 99 4赵丽 ,赵嘉训 ,牛悦峰等高效液相色谱法测定人血浆中的普鲁卡因 J中国医学检验志 2005,6(5):356 358 5于仁娈 ,魏振满 ,刘峰群等 RP-HPLC测定盐酸二甲双胍的血药浓度 J.懈放军药学学报
15、 .2005.2l(4):300 302 6马开 ,秦文杰 HPLC测定痛可停胶囊中欧前胡素和异欧前 胡素含量 J.中成药 .2005.25(10):80l一 803 7曾海静 .章小萍 .曹丽冰 HPLC测定复方葛根合荆中葛根素含量 J广东药学 .2005.l5(5):l0 12 8牛乐 .李建科 . 高效液相色谱技术 (HPLC)在食品营养及安全性分析中的应用 J. 食品研究与开发 .2005.4(2):120-123 9黄国宏 .高效液相色谱技术在食品分析中的应用 J. 食品工程 .2006.4(12):47-51 10商振华 ,于亿年 ,郭为反向高效相色谱一紫外吸收法测定灵芝中的氨基酸
16、的含量 J药物分析志 .1994， l4(4)： 30 33 11Mar aM.Yust.Justo Pedroche， Julio Giro Calle， Determination Of tryptophan by high performance liquid chromatography of al kaline hydrolysales with pectrophotometric. detection FoodChemistry 85(2004)317-320 12李克，王华娟，潘朝晖离子对反相高效液相 色谱法同时测定复合维生素片中 4种水溶性维生素色谱， 2003， 21(1)： 166 68 13成志强，孙成均，黎源倩反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中 8水溶性维生素分析化学， 2001， 29(9)： 1068 1071 14宋虎跃 ,徐国栋，吴勇民 . 高效液相色谱技术的应用 J. 内蒙古石油化工 .2007(6):17-18 15张梅凤 .高效液相色谱法在生物样品农药残留分析中的应用 J.农药研究， 21 26. 16 崔莹，高效液相色谱分离、检测磷脂研究进展 J.现代科学仪器， 2006:25 28
