1、毕业论文 开题报告 生物工程 海带多糖的提取工艺研究 一、 选题的背景、意义 多糖是组成生物高分子家族中的一个最丰富多采的成员，它是由单糖组成的天然高分子化合物，已知的天然多糖化合物约有 300 加多种，广泛存在于植物、动物和微生物组织中，具有多种重要的功能，其中两种最重要的功能是结构物质和能量物质。如组成植物细胞壁的纤维素和组成虾蟹的甲壳属于结构物质，使组织具有强度。而植物中的淀粉及动物中的糖元是贮存的食物，它能随代谢的需要转变成能量。近二十多年来，由于分子生物学和细胞生物学的发展，发现多糖及缀合物参与细胞的各种 生命现象的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受，这与细胞表面的多糖体的介导有密切
2、关系。而且多糖又是细胞表面对各种抗原和药物的受体，因此多糖作为支持组织和能量来源的传统观念已被突破。科学家们从大量药理和临床研究发现，从天然产物中分离出的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体免疫功能而对正常细胞没有毒副作用。自 1983 年美国发现第一例 AIDS 病患者， 1983年从患者血清中分离出一种淋巴结病毒（ HIV）以来，多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视 ,已成为新药研究的热点之一，而其中最为重要的是从药用植物 中提取的水溶性多糖。现已发现多糖化合物对机体的免疫调节作用主要是通过激活巨噬细胞，激活网状内皮系统，激活 T 和 B 淋巴细胞，激活补体以及促进各种细胞
3、因子的生成等方式和途径来实现的。这种免疫调节作用具有以下两个特征：（ 1）最佳剂量的选择。对多糖不论进行动物的免疫功能试验还是抑制肿瘤试验都发现有一个最佳剂量值 ,剂量过高或过低都会影响实验结果。多糖在最佳剂量时，其活性最高，超过或低于最佳剂量，活性就会明显降低，这与一般药物不同。（ 2）没有直接细胞毒性。多糖作为药物的最大优点就在于毒副作用很小，它的抗肿瘤活性是宿主介导 性的，因此在体外试验时，肿瘤细胞的存活率几乎可达 100%。 至今多糖的结构与功能的关系并不十分清楚，但高级结构对功能的影响比一级结构还重要，这一点已为科学家们所首肯。而决定高级结构的重要因素是多糖分子链内与链外的氢键。除了
4、主体构型是决定多糖生物活性的决定因素外，多糖的分子量、溶解度等也能影响其生物活性。近来多糖受体的发现对阐明其作用机理有重要意义。当多糖与受体作用时，只有分子中的几个寡聚糖片段与受体结合，因此可以推测，多糖也许像蛋白质和酶一样，在分子中存在一个或几个寡糖片段的“活性中心”，但这尚需进一步证实 。 到目前为止，对多糖的研究重新引起了人们的重视，但与蛋白质和核酸的研究相比还有很大的差距，还不够深人，这主要反映在以下几个方面：（ 1）多糖的结构与功能的关系至今仍是多糖研究的薄弱环节，大多还是凭科学家们的分析和推测，而对多糖的溶液构象和晶体结构的研究几乎还是空白。（ 2）多糖的结构测定方法还远未达到像核
5、酸和蛋白质结构测定那样自动化、微量化和标准化。由于多糖分子中每个多糖残基都有多个反应点，这使糖苷键具有多种连接的可能性，而构型又有 和 两种，这使得多糖的结构测定远比蛋白质和核酸结构测定来得困难虽然近来有人用 质谱和核磁共振以及毛细管电泳等技术来测定多糖的结构，但局限性较大，还未形成成熟的可靠的体系。（ 3）多糖的合成（目前实际上只是寡糖的合成）也远比多肤和多聚核昔酸的合成复杂和困难。（ 4）多糖在体内的作用机制还未十分明了。 尽管对多糖的研究还存在上述这些问题，但多糖的应用前景表明了多糖研究的强大生命力。相信不久的将来，天然多糖化合物将在疾病治疗和保障人类健康长寿方面作出它的贡献。 海带是一
6、种具食用和药用价值的大型海藻，隶属于褐藻门，海带目，海带科，海带属，中药名称为“昆布”，海带的大部分生物活性与其主要成分多糖密 切相关 1。海带多糖是存在于海带细胞间和细胞内的一类天然生物大分子物质 2。海带中主要有 3 种多糖，即褐藻胶、褐藻糖胶和海带淀粉，褐藻胶和褐藻糖胶是细胞壁的填充物质，而海带淀粉存在于细胞质中。 研究表明，海带对外界恶劣环境所表现出的抗逆耐受能力与它们所含的海带多糖有直接关系，海带多糖还具有稳定细胞膜和蛋白质结构的功能 3,4。国内外学者的研究表明，从海带中分离出的多糖具有抗癌、防癌和增强免疫等功能，且有预防高血压、动脉硬化和有助于减肥等特殊功效。海带多糖在医药、食品
7、、化妆品、农业等方面也具有广阔的应用前 景 5,6。我国的海带产量居世界首位，海带来源丰富，价格相对便宜。研究海带多糖的高效提取方法，可以最大程度地提取海带多糖，提高海带多糖的得率，从而提高海带的经济价值，这是国内外学者非常关注的问题。 二、 相关研究的最新成果及动态 （一）水提法 水提法为海带多糖的传统提取方法。邢氏等 7采用固定因素法对海带多糖的水提条件进行优化，以多糖提取率为指标得最佳工艺：提取温度为 100，提取时间为 6h，加水量为90mL/g。张氏等 8采用单因素分析法对硫酸酯化多糖的提取工艺条件进行了优选，得出提取时间为 2h、 提取温度为 90、加水量为干净海藻质量的 25 倍
8、。该工艺多糖产率达 1.99%，其主要理化指标“硫酸根 +多糖”质量分数为 61.26%。 （二） 酸提法 周氏等建立了一套用改良酸化法提取、纯化海带中多糖类化合物的方法，即在提取海带多糖的传统方法的基础上，延时、增加固液比、稍稍提高水浴温度，通过酸液的充分作用，使海带细胞、细胞壁充分吸水膨胀而破裂，从而使海带多糖充分游离出来，提高产量。该法将粗品用乙醇、丙酮、 TCA 沉淀交替处理，同时可以去除脂肪和蛋白质，脱色效果较好。经测定，采用该法，海带总多糖（含海带胶）的得率为 35.1%9。 （三） 碱处理法 刘氏等 10以干海带为原料，采用二次浸泡和碱处理工艺，以褐藻酸的提取率作为多糖提取率的评
9、价（ 70二次水浸提后，采用 20 倍 1.5%Na2CO3， 60碱提 1h），提取率达到76.88%，高于其它方法。并指出，用 Na2CO3 溶液作为浸提介质较 NaOH 效果好，其浓度应控制在 1% 2%。 （四） 分类提取法 李氏等 2根据海带多糖中的褐藻胶不溶于稀酸溶液而其钠盐溶于水的性质，以 0.1mol/L HCl 水溶液从海带粉末中提取褐藻糖胶和褐藻淀粉（根据溶解度的差异，用不同浓度的乙醇沉淀分离），而使 含量很高的褐藻胶留存于滤渣中，然后以 1%Na2CO3 溶液使其生成褐藻酸钠来提取。 （五） 微波法 高氏 11等根据微波射线的穿透性极好，在接近环境温度下抽取所需的有效成分
10、，对热敏性成分的浸提极为有效的特点，利用微波技术研究了固液比、微波作用时间和微波功率对海带多糖的影响规律，采用正交试验，得出了海带多糖提取工艺的最佳参数组合：以水为提取剂，微波功率为 400W，提取时间为 7min，固液比 1 90（ g/mL）， pH 值为 8.0。在此条件海带多糖的提取量为 71.66mg/g。研究表明，该方法提取多糖，与传统加热浸提取时 间相比，热效率高，升温快速均匀，能大大缩短萃取时间，提高萃取效率。 （六） 超声波法 廖氏等 12以海带多糖得率为指标，得出最优提取条件为：海带干粉加入 62.5 倍体积水，pH2.0 的条件下超声波提取 45min。按此条件提得粗提物
11、中糖含量为 28.19%，大分子的杂质含量为 0.97%。而酸提法得到的多糖含量为 19.8%，大分子的杂质为 1.92%。二者差别显著（ P 0.01），且抗肿瘤实验表明两种提取方法效果相当，提出该方法为一种有希望的多糖提取新方法。王氏等 13采用气升式反应器超声破碎海带提取硫酸酯多糖，提取 率高达 1.86%，比传统的水提法高。 （七） 酶解法 刘氏 14采用酶解法从海带中提取制备海带硫酸多糖（ LPS），即海带浆加入纤维素酶、果胶酶和蛋白酶， 50水解 4h，而后升温至 90，使酶失活，冷至室温进行过滤，取滤液加入氯化钙，离心去除海藻酸钙；上清液加入十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）与
12、LPS 结合沉淀，离心收集 CTAB-LPS 沉淀物；加入氯化钙溶液进行盐解，游离出 LPS 后加入乙醇使其析出，经离心烘干得 LPS。与水煮提取法比较，该提取工艺得到的 LPS 产率是前者的 2倍。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（ 技术路线）、难点及预期达到的目标 本试验采用水浴提取法 ， 提取分离 多糖， 研究海带 多糖 的提取工艺 ， 在提取时间、温度、固液比的单因素试验的基础上 ， 考虑试验条件 ， 选择提取时间、提取温度和固液比作为影响因素 ， 指标仍为 多糖 提取量 ， 进行正交试验 ，获得 水浴提取 多糖的最佳提取条件 。 难点： 水提取法提取液体积过大 ,增加了分离和纯
13、化的难度。 预期 目标： 通过正交试验确定各因素对 多糖 提取量的影响 及最佳提取条件 。 四、论文详细工作进度和安排 2010.11.22 学生选题 2010.11.26 前 布置论文任务 2010.11.23-2011.1.10 完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译 2011.3.18 前 在学校指定时间完成开题答辩 2010.3.18 2010.5.18 进行课题 实验 2010.5.23 前 完成并提交毕业论文 2010.6.10 前 在学校指定时间进行毕业论文答辩 五、主要参考文献 1 钱风云，傅德贤，欧阳藩海带多糖生物功能研究进展 J中国海洋药物杂志， 2003（ 1） 55 6
14、0 2李林，罗琼，张声华海带 多糖的分类提取鉴定及理化特性研究 J食品科学， 2003，21（ 4）： 28 32 3 Altamirano H， Murami A， Kawai H High light stress in the kelp Ecklonia cava Aquatic Bomny， 2004（ 79）： 125 135 4 Koo J G Isolation and purification of fuooidans from Laminaria religiosa and Undaria pinnatifida in Korea Han gule Susan Haknoec
15、hi， 1995（ 2）： 27 36 5徐桂花，徐惠娟海带面包的制作工艺 J农业科学研究， 2005， 26（ 2）： 37 39 6钱凤云，傅德贤，欧阳藩海带多糖功用研究进展 J精细与专用化学品， 2003（ 8）：13 15 7邢杰，刘守涛，高君等海带多糖的提取及组份 L1 的分离与鉴定 J抚顺石油学院学报， 1998， 18（ 1）： 8 8张彦民，李宝才，朱利平海带中硫酸酯化多糖提取研究 J云南化工， 2003， 30（ 5）： 28. 9周裔彬，汪东风，杜先锋等酸化法提取海带多糖及其纯化的研究 J南京农业大学学报， 2006， 29（ 3）： 103 107 10刘秀河，毕德成提高海带功能性成分提取率的研究 J食品工业科技， 1999， 20（ 3）： 29 11高梦祥，李琳微波强化浸取天然色素机理探讨 J食品科学， 2005， 26（ 6）： 78 80 12廖建民，张瑾，沈子龙超声波法提取海带多糖的研究 J药物生物技术， 2002，9（ 3）： 157 13王谦，黄猛，赵兵气升式反应器超声破碎海带提取硫酸酯 多糖 J过程工程学报，2001， 1（ 1）： 58 14 刘轲，王琪琳，吕辉等海带硫酸多糖的提取、纯化及理化分析 J 中国生化药物食品与发酵工业杂志 ， 2002， 23（ 3）： 114
