1、毕业论文 开题报告 生物工程 生物自显影法筛选白蔹醇提物抗菌活性 1 选题的背景和意义 在没有化学合成农药之前 , 最早的农药有不少是从植物中提取出来的 , 有些植物天然活性物质已开发成商品用杀虫剂 , 如鱼藤酮、烟碱等。但自 20 世纪 40 年代以来 , 有机化学合成农药纷纷代替了植物性农药而雄居市场 , 致使植物性农药的研究一度陷入低谷。由于有机农药具有品种多、效果好、见效快和使用方便等突出优点 , 一时普遍认为似乎只有化学药剂才是解决植保问题的有效方法 , 而忽视了使用农药可能带来的多方面不良影响。由于人们对化学农药 的不合理使用及其药剂本身的固有缺点 , 农药在使用中产生了一系列公害
2、问题 , 例如环境污染、人畜中毒、杀伤天敌、破坏生态平衡等严重问题 , 这些不良影响已引起人们的普遍关注 , 因此 , 对农药进行重新评价 , 开发对人畜及环境安全的生物合理性农药是解决上述问题的重要途径之一 。植物源农药作为生物合理性农药的一个重要组成部分 ,正越来越受到人们的重视 , 因为植物是生物活性化合物的天然宝库 , 其产生的次生代谢产物超过 40 万种 , 主要化学物质为萜类、生物碱、黄酮、甾体、酚类及独特的氨基酸和多糖等。目前人们已经从植物、微生 物中提取抗真菌、细菌、病毒、线虫、杀虫、除草的活性物质。因此开发利用植物资源用于有害生物防治的前景十分广阔。从植物中探寻新的活性先导化
3、合物或新的作用靶标 , 通过类推合成或生物合理设计新农药的开发已成为当前农药化学和农药毒理学研究的热点。 1 人类自从古代就记载了许多具有杀虫或控制害虫、抗菌或杀菌作用的植物如中国、印度等东南亚以及一些非洲国家的劳动人民积累了许多利用植物杀虫防的经验。几个世纪前 , 我国人民就已知道植物中含有抗菌物质 , 在许多实例中 ,这些化合物能以天然的抗性或防御体系来抵抗微生物或其他病害。 某些化合物具有殊味道或气味 , 已经在香料工业中使用 , 使用药草和香料作为调味品或食品防腐剂 , 许多文献已报道了它们的特性及活性成分。较早用于植物病害防治的有大蒜汁、洋葱汁、棉籽饼、辣蓼、五风草等 , 至今人们已
4、经调查和研究了一些植物的杀菌、抗菌活性。 不同的抗菌、杀菌植物 , 其有效成分分布在植物根、茎、叶、花、果、种子等不同部位 , 如厚扑存在于叶中、苦瓜存在于果实中等。同种植物不同部位活性成分的含量亦存在差异 , 黄梁绮龄等对香港地区四种红树植物的根、茎分别用 95% 乙醇浸取 , 其浸取物对三种植物病菌抑制活 性存在一定差异 31 。研究有效成分在植物中分布 , 应针对具体的杀菌、抗菌植物 , 分成根、茎、叶、花、果实等部分 , 采用生物测定法来分析活性成分在植株中的部位 , 只有研究清楚有效成分在植物中的分布 , 才能有的放矢地对其开发利用。 2 有关天然产物的提取方法很多 , 常用的溶剂提
5、取法包括浸渍法、渗漉法、水蒸汽蒸馏法、煎煮法、回流法、连续回流法等。近年来又出现了破碎提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界萃取法等新方法。同一种提取方法 , 不同的提取溶剂提取的效果存在差异 , 一般采用系统溶剂进行活性物质的提取 , 包括溶剂连续提取和溶剂平行提取 , 前者可以使植物中活性成分不造成漏筛 , 后者能确定最佳的提取溶剂。林捷等分别用乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙醚在室温下浸提柚皮提取物 , 结果表明用乙酸乙酯提取物抑菌力最强。王维华等用水、95% 乙醇、丙酮提取连翘中抗菌有效成分 , 以 95% 乙醇的提取物抑菌最强。提取中可加入提取辅助剂如酸、碱、表面活性剂、纤维素酶等
6、提高提取效能 , 增大有效成分的溶解度 , 增加有效成分在提取过程中稳定性及除去或减少某些杂质。 N huyen V an Chuyen 等从 Kumaza 提取活性物 质时加入一定量的纤维素酶 , 结果可增加提取物的抗菌活性。同时提取效能还与溶剂的比例、提取时间、提取温度等有关。 3 抗菌机理 抗菌剂的抗菌作用 , 一般是指抗菌剂对微生物的生命活动所产生的不良影响和后果。这种不良影响和后果最集中的表现就是影响微生物的生长、繁殖以至死亡。也就是说抑制微生物的生长与繁殖或杀死微生物的作用。抗菌剂和微生物之间的关系 ,可以看作微生物与环境关系 ,特别是对微生物有毒性的环境关系。抗菌作用机制有以下几
7、个方面 : ( 1 )干扰细胞壁的合成。细菌细胞壁的重要组分为肽聚糖 ,抗菌剂对细胞壁的干扰 作用 ,主要是抑制多糖链与四肽交联的连结 , 从而使细胞壁失去完整性和对渗透压的保护作用 , 损害菌体而死亡。 ( 2 )可损伤细胞膜。细胞膜是细菌细胞生命活动的重要结构部分 ,因此当细胞膜受损伤、破坏时 ,将导致细菌死亡。 ( 3 )抑制蛋白质的合成。蛋白质的合成需要活化的氨基酸 , 且在各种酶参与下在核糖体上完成。抑制、阻碍和改变其中任何一组结构或其合成环节之一 , 都能导致蛋白质合成过程变更、停止 ,使细菌死亡。 ( 4 )干扰核酸的合成。总的说是阻碍遗传信息的复制 , 包括 DNA、 RNA
8、的合成以及按DNA 模板转录 mRNA 等 。 4 2 相关研究的最新成果及动态 植物中的化学成分有数十种甚至数百种化合物 , 但其中具有抗菌、杀菌活性成可能只有一种或几种 , 为了开发利用植物杀菌、抗菌活性资源 , 并从中获得有效分 , 鉴定结构 , 直至产业化应用 , 今后需要在以下几个方面进行更深入的研究 : (1) 加强杀菌、抗菌植物资源的调查研究。通过历年大规模药用植物调查 , 我国药用植物的种数为 8 000 种左右 , 而作过抗菌、杀菌活性研究的植物仅仅涉及菊科、唇形科等十多个科植物 , 尤其在一些偏远地区、山区中可能存在着较多与自然界 协同进化的抗菌、杀菌植物资源。另外 , 一
9、些具有杀虫活性的植物资源也可以进行抗菌、杀菌活性方面研究。植物中具有抗菌、杀菌活性物质主要是香精油类即酯、醛、酮、酚和萜烯等。植物作为天然的化合物宝库 , 其中的氨基酸、生物碱也可能具有抗菌、杀菌活性 , 值得作为研究对象。 (2) 建立快速、准确的活性物质筛选方法。杀菌、抗菌活性物质筛选方法正确与否对发现新的化合物具有重要作用 ,在天然产物农药研究过程中 , 常规的筛选方法难以对微量的分离物进行抗菌活性跟踪 ; 另外 , 在对化合物进行抗菌活性测定时 , 目前应用较多的是离体活性筛选 , 这种方法有可能导致一些活性物质的漏筛。而植株筛选法通常是决定该化合物是否具有实际应用价值的有效方法 ,
10、在活性物质筛选中值得重视。由于天然产物研究本身没有固定的方法论 , 所以需要根据每个研究对象的特点 , 采用灵活的研究方法 , 如科学合理的提取分离体系和检测方法 , 同时要加强与生物学科、化学学科之间的交叉与合作 , 这样才能推动植物源杀菌剂研究的深入发展。 (3) 植物源杀菌剂的产业化技术研究与应用。现今登记的植物源农药几乎都是杀虫剂 , 而杀菌剂产品却甚少 , 可见植物源杀菌剂的产业化还相当薄弱。为此 , 第一 , 要加快实验室的提取分离技术工厂化的步伐 , 例如在实验室中采用超临界萃取技术提取活性成分 ; 第二 , 可以利用生物技术如组织培养技术、细胞培养技术 , 对植物资源进行快速繁
11、殖 , 满足工厂化对原材料的需求 ; 第三 , 以实验室分离到的活性物质为先导化合物 , 合成一系列的结构相似的化合物进行活性物质的结构优化 , 获得高活性的化合物 , 最后工厂化生产。 5 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法、研究难点及预期达到的目标 3.1 课题研究内容 本课题主要研究白蔹醇体外对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌和金黄色葡 萄球菌为代表的革兰氏阳性菌的抗菌性能。 白蔹又名白根、猫儿卵 ,首载于神农本草经 ,归为下品。具有清热解毒、消肿散结、生肌止痛之功能。中华人民共和国药典 2005 版收载的白蔹为葡萄科白蔹 ( A m pelopsis japonica ( Thunb.
12、 ) Makino) 的块根。为了进一步阐明白蔹的化学成分 ,为植物的深层开发提供依据 ,作者对白蔹的化学成分进行较为系统的研究 ,从其乙酸乙酯提取物中分离得到了 8 个化合物 ,利用理化常数和波谱学方法 ( 1H-NMR、 13C-NMR) 鉴定了它们的结构 ,分别为没食子酸 、原儿茶酸、龙胆酸、白藜芦醇、大黄素、羽扇豆醇、 谷甾醇、胡萝卜苷 。 6 白蔹组成 1) 多酚类 多酚类是白蔹的主要化学成分，也是其主要活性物质。研究白蔹化学成分的首篇报道见于 1 9 9 5 年，俞文胜等用 Sephadex LH-20 柱层析从白蔹的乙酸乙酯提取物中分离得到一系列多酚类化合物，包括没食子酸， 1,
13、2,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,6-四氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,4,6- 四氧 - 没食子酰基 - -D- 吡喃葡萄糖， 1,2,3,4,6-五氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，二聚没食子酸， 1,4,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，2,4,6- 三氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 2,3,4,6- 四氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 6- 氧- 二聚没食子酰基 -1,2,3-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，槲皮素 -3-氧 - -L-吡喃鼠李糖，槲皮素 -3-氧 -(2- 氧 -没食子酰基
14、)- -L- 吡喃鼠李糖。这些多酚类物质有的具有较强的抗脂质过氧化活性，有的具有很强的抗毒肝素活性。 7 2）有机酸类 用硅胶柱层析从白蔹的乙醇提取物 中分离得到脂肪酸三十烷酸和二十八烷酸。邹济高分离得到十六烷酸和富马酸。此外，白蔹还含有酒石酸， 龙脑酸等。 3） 三萜、甾醇及其苷类 用硅胶柱层析从白蔹乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分离得到 -谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇 - -D- 葡萄糖苷。邹济高等 4分离得到羽扇豆醇。 4）其他 白蔹中的蒽醌类主要有大黄素甲醚、大黄酚和大黄素等。 Lee 等用活性追踪法，从白蔹的甲醇提取物中分离得到具有抗肿瘤活性的 momordins，包括 momordin I，
15、 Id 和 Ie。白蔹中还含有卫茅醇、淀粉和黏液质等。 8 生物 自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法， 具有操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高等优点，是一种快速测定生物活性的方法。可用于对具有抗菌 /真菌， 抑制胆碱酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性的天然产物的筛选，可实现活性指导的提取分离。利用 TLC 生物自显影，可测定单体活性化合物的最小抑制浓度 ( MID)，通过与对照品的 MID 值比较，能够推测该化合物活性的强弱。此外，利用 TLC 生物自显影定性及定量的特征，还可对食物、水样及动物组织中抗生素残留量进行监测。 以中药白蔹为基础，通过利用生物自显影 法来快速
16、分析测试其醇提物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌性能 。 9 薄层层析 -生物自显影法 (TLC-Bioautography) 是近年来应用的一种将薄层层析和生物活性测定相结合的抗菌活性物质检测方法 7-9。利用薄层色谱的分离能力将少量混合物 (如植物提取物、微生物代谢产物等 )在薄层板上通过展开剂展开后 ,使薄层板与含有供试微生物的培养基相接触 ,在一定条件下培养一段时间后 ,非活性部位会被生长出的供试微生物所覆盖而呈现背景色 ;活性部位由于抗菌成分的存在 ,指示微生物的生长受到抑制而呈现抑菌斑点 ,这样就可以 初步了解混合物抗菌活性成分的相对极性 ,为活性单体化合物的分离提供依据。采用 T
17、LC-生物自显影法检测植物内生真菌提取物 中抗菌活性成分鲜见报道 7,本文在 TLC-生物自显影的基础上结合细胞活力 MTT测定方法 ,对种滇重楼内生真菌菌液和菌丝正丁醇提取物中抗菌活性成分进行了检测 ,为进一步分离纯化内生真菌中抗菌活性成分提供了依据 。 10 3.2 研究方法 本课题采用的研究方法有醇提取法、薄层层析 -生物自显影法 (TLC-Bioautography) 3.3 研究难点 本研究的主要难点为白蔹的内含物不易提取 。 3.4 预期目标 通过本课题的研究，通过利用生物自显影法来快速分析测试其醇提物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌性能在测试白蔹不醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
18、的抗菌性能的基础上，建立定性及定量的测试方法，得到白蔹醇提物抗菌性能的具体数据，为开发功能性中药材提供理论和实验基础。 5 参考文献 1 植物提取物体外抑菌试验的研究 胡建军 刘利林 黄金奎 余淑珊 许宗运 塔里 木农垦大学学报 2004 年 6 月 第 16 卷 第 2 期 2 一种通过快速显色筛选植物提取物的抗菌活性的方法 周 英，钱利安，黄赤夫 食品科学 3 F rank M uller2R iebau, Bernhard Berger and O k tay Yegen1Chem ical compo sit ion and fungitoxic p ropert ies to phy
19、topathogenic fungi of essent ial o ils of selectde aromat ic p lants grow ing w ild in turkey J 1J A gric Food Chem ,1995, 43: 2262 2266 4 中草药提取物的体外抑菌活性研究 张显忠，郭爱军 2 , 李艳玲，苗 苗 中华医院感染学杂志 2006 年第 16 卷第 5 期 5 HOFIREK B. Diagnostic test with methylene blue, resazurin, thionine and triphenyl tetrazoliumch
20、loride(TTC) and its use in the diagnosis of rumen acidosisJ. Vet Med (Praha), 1972, 17(2): 61-68. 6 白蔹的化学成分 赫军，羡冀，宋莹莹，宋少江 沈阳药科大学学报 2 0 0 8 年 8 月 第 25 卷第 8 期 【 3】植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展 (综述 ) 吴新安，花日茂，岳永德，朱有才 安徽农业大学学报 , 2002, 29 (3) : 245 249 7 白蔹的药理作用及临床应用 李洪娟，张 蕾，王术光 食品与药品 2007年第 9卷第 10A期 8 白蔹的化学成分 ( ) 赫军，羡冀，宋莹莹，宋少江 沈阳药科大学学报 2009.03 第 26卷第 3期 9 一种通过快速显色筛选植物提取物的抗菌活性的方法 周 英，钱利安，黄赤夫 食品科学 2009.06 10 TLC-生物自显影 -MTT法检测滇重楼内生真菌中抗菌活性成分 赵江林，徐利剑，黄永富，周立刚 中国农业大学农学与生物技术学院 ,北京 100094
