1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 天然色素发酵工艺优化 1 选题的背景和意义 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一类天然红色素的总称，通常 由 3 个吡咯环 （ 其中的一个吡咯环 C2 上带有一个甲基， C3 上则有一个戊基 ） 组成的甲氧基吡咯骨架结构 ， 它 是一种红色物质，可由粘质沙雷氏菌（ Serratia marcescens）等细菌合成的次级代谢产物（ secondary metabolite） 。 PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水； PG 对温度稳定但受 pH 的影响较大； A1， Ca， K ， Ba 等金属离子对 PG 的稳定 性影响不大， Z
2、n 有使 PG 增色的作用， Mg 和 Mn 对 PG 有一定的破坏作用 。 现阶段，主要是通过微生物发酵来获得灵菌红素，能产生灵菌红素的微生物主要有链霉菌属（ Streptomyces）、沙雷氏菌属（ Serratia）和假单胞菌（ pseudomonas）等种属。人们的研究主要集中在沙雷氏菌属其抗肿瘤方面，美国国立癌症研究 (NSI)Melvin 等发现 PG 在平均 IC50 为 2.1 mol L-1时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、 乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞株中的 57 种不同的人癌细胞 均有抗性作用 8。然而，灵菌红素的应用远远不止这些，由于其无毒
3、抗菌性能，可以作为一种绿色的饲料添加剂，且由于其是一种天然色素，可以作为纺织工业中的染料。 本实验便是以一株产红黏质沙雷氏菌为出发菌株，通过优化培养基组成及成分配比，使用低成本的农作物或工业废弃物来生产和提高灵菌红素的产量，同时降低成本。 2 相关研究的最新成果及动态 近年来灵菌红素在医学上、环境治理 、食品色素 以及 纺织 业上的应用越来越广泛。 首先，医学上抗肿瘤作用。 PG 对比起另外一些化学疗法药剂，如 环磷琉胺（ cyclophosphamide）具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM 时才具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高。 它能在 铜 离子配合下破
4、坏癌细胞的双链 DNA。而癌细胞相比非癌组织具有较高的铜离子浓度（ 3.5 倍），这也成为 PG 对癌组织高针对性的基础。 PG 还 可以通过抑制细胞中型2 拓扑异构酶 I 和 的活性而进一步达到破化 DNA 复制的目的。 PG 可破化细胞内的 线粒体 ， 高尔基体 和 溶酶体 对细胞质的 pH 梯度，降低细胞内 ATP水平。这是由于 其 可以在这些细胞器的膜上起到离子孔的作用，而抵消氢氯离子的同向转运。 灵菌红素可以激活细胞内 细胞凋 亡 途径。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8，继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面，它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ AIF）而触发非
5、半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。 其次，在环境治理上，韩国科学家于 1996 年首次在海洋中发现一种微生物 “ 哈赫拉 ”（ Hahella）。基因组测序分析后发现 其 能产生可以清除赤潮的灵菌红素。将灵菌红素撒在赤潮中，只需十亿分之一的浓度， 1h 后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。这对治理河湖的富营养化及海里的赤潮，维护地球环境具有 重大 意义。 韩国科学家已为 其 申请了韩国和国际 专利。 再次，作为 食品添加剂，合成色素发明之后，天然色素逐渐被取代。随着毒理学和分析技术的不断发展和人们生活水平的提高，发现某些合成色素食用过量有致癌危险，而天然色素具有较高的安全性 。可是 ， 天然色素不能
6、满足现代食品工业发展的需要，开发新品种 以及改进原有 的天然色素 （如灵菌红素）迫在眉睫。 最后， 在纺织业方面，现如今，随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需求日益扩大，为了满足社会需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法、难点 及预期目标 3.1 研究内容 本课题所要研究的是 黏质沙雷氏菌培养基优化，通过改良培养基的选择以及各种成分比例来提高灵菌红素产量 3.2 采取的研究方法、技术路线 首先进行单因素确定以及正交实验，然后通过 P-B 实验确定培养基中影响灵菌红素产量的主要因素之后再使用响应面实验确定
7、最佳培养基。 3.3 课题的研究难点 ： PB 实验以及响应面实验所涉及的变量多，导致实验操作较为繁琐，且培养基优化不确定性以及沙雷氏菌利用不稳定，可能导致优化结果不理想。 3 3.4 实验方案 1，先采用单因实验，分别考察 C 源、 N 源、水、无机 盐等种类及浓度 2，考虑不同碳氮比对灵菌红素产量影响 3，根据单因子结果进行 PB、爬坡、响应面等实验设计，确定最优发酵工艺条件 4，根据统计学实验设计优化的最优条件来实验验证 3.5 预期达到的目标 ： 找到目的菌株培养基的最佳配比， 进行下一步的发酵工艺优化， 提高灵菌红素的产量。 3.6 相关仪器及实验 耗材 722 型分光光度计，分析天
8、平，生化培养箱，低温冰箱，超净工作台，容量瓶， pH 酸度计，培养皿，试管，酒精灯，涂布棒，接种针等。 4 论文工作进度和安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料， 确 定实验方案 。 2010 年 11 月 1 日 -12 月 18 日： 继续查阅文献资料，做好实验室的器材药品准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日： 进行单因素实验、 PB、爬坡、响应面等实验设计，确定最优的发酵工艺条件等实验设计。 2011 年 4 月 20 日 -5 月 19 日： 对实验做初步
9、的总结与归纳，并补充相关实验数据 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业论文 及答辩。 5 参考文献 1刘同军 , 杨海龙 , 唐华 . 灵菌红素的研究进展 J. 食品与药物 . 2007, 9(08)： 47-50. 2袁保红 , 杜青平 , 蔡创华 ,等 . 海洋细菌 Pseudomonas sp.色素的提取及稳定性的研究 . 海洋通报 J, 2005, 6(24): 92-96. 3Someya N.,Nakajima M.,Hamamoto H.,et al.Effects of light conditions on prodigiosin stability
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