1、毕业论文 开题报告 生物工程 天然色素应用开发初步研究 一、 选题的背景、意义 天然色素来源广泛、成分复杂、种类繁多，按提取方法可分为四大类：即动植物体经榨汁或溶剂抽提而成的液态或固态色素，有色动植物体干燥、磨碎而得到的粉状色素，经微生物发酵、代谢产物分离成液体或进一步加工成固体粉末的色素，以天然产物为原料经酶作用而制得的色素。除原来已经使用的姜黄、甜菜红、叶绿素铜钠盐、辣椒红、红曲米色素、胡萝 I-素外，最近又研究开发出玉米黄、高粱色素、萝卜红、玫瑰茄、栀子黄、茶色素、靛蓝、高粱红、黑米色素、红花色素等。我国天 然色素产业的发展已经初具规模，全国天然色素总产量已达十余万吨，其中最具代表性的有
2、焦糖色素 (即糖色 )、栀子黄、栀子蓝、姜黄、苋菜红、辣椒红、茶色素等 1。 灵菌红素（ prodigiosins， PG）是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigiosin, prodigiosin 25-C， metacycloprodigiosin（ MP） desmethoxyprodigiosi uncedylprodigiosin（ UP）等，是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 2,3， 虽然其对于生产者的作用和意义还不是彻底明了，但现在它已被发现具
3、有多种生物活性作用，能抗癌，抗微生物，抗 疟疾 ，抗霉，免疫抑制的作用。其中抗癌方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质。 随着畜牧业规模化、商业化的发展，兽药及 饲料添加剂在畜牧业生产中广泛运用，在促进了养殖业生产发展的同时，也带来很大的负面影响。动物的高密度饲养带来的环境污染，饲料添加剂带给动物产品的体内残留量过高而导致人类疾病的危险性增大，特别是一些要求限制的促生长激素和有毒物质的添加更引起消费者的恐慌。有些对人的健康产生直接危害，细菌的耐药性给抗生素及其他药品的现代化学疗法带来了极大的困难，还造成环境污染，对动物健康产生危害而影响畜
4、牧业发展 ，因禽兽产品安全问题而影响出口贸易等。开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。近年来，国内外 广大学者对安全饲料添加剂的开发和应用进行了大量的研究，相继开发出了大量产品，如酶制剂、微生态制剂、功能性寡糖、酸化剂和中草药制剂等 4,5,6,7,。 （ 1）茶皂素，其作为畜禽饲料添加剂，能明显提高机体的免疫功能，增强抗病能力；但糖萜素有明显的溶血毒性，不能添加到鱼类饲料和养殖池塘中。 （ 2）微生态制剂，以活体形式在动物消化道中与病原菌进行竞争抑制，增强动物机体的免疫功能，并直接参与胃肠道微生物的平衡，加快达到胃肠道功能的正常化，产品没有抗药性和药物残留。但目
5、前适宜的菌种较少，且较易失活，耐 pH 较差 难 以与微生物竞争时处于优势地位 8。 （ 3）酶制剂，酶制剂研究中最为重要的问题是在生产及其处理过程中如何保持酶的稳定性和饲喂 效果。 （ 4）酸化剂，利用几种特定的有机酸和无机酸制成复合酸化剂，能迅速降低 pH 值，保持良好的缓冲值和生物性能。 但其只能减少抗生素的使用而不能替代。 （ 5）寡聚糖，促进动物后肠有益菌的增殖，提高动物健康水平的微生态调节剂功能；通过促进有害菌的排泄、免疫佐剂和激活动物特异性免疫等途径，提高其整体免疫功能，防治疾病发生。但寡糖本身成本较高，生产效率较低， 且属于非消化糖类不能添加过量 。 （ 6）中草药制剂，从天然
6、植物提取，主要成分有多糖、植物黄酮、植物类黄酮 (多酚类 )、以绿原酸为代表的植物有机酸和寡糖。具多种功能如提高兽类生长速度，免疫活性等无毒副作用，安全性较高 。但目前一些中草药饲料添加剂在开发应用中还存在产品添加量大、有效成分不明、作用机理不清、作用效果不稳定、剂型单一、缺乏毒理安全方面的研究，原料和产品质量控制标准不完备等问题 9。 二、相关研究的最新进展与动态 随着我国经济的发展，居民生活水平的提高，人们对食品的安全性的要求越来越高。天然色素是人们通过一定的技术手段从自然界的 动植物细胞组织中取得的色素，与合成色素相比，它们具有无毒、色彩自然的特点，并且大多数的天然色素还具有一定的保健、
7、营养及药理作用。因此，近年来广大科技工作者对天然色素的资源开发和应用进行了大量的研究。 随着畜牧业规模化、商业化的发展，开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。灵菌红素作为无公害天然抗生素，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，不干扰肠道正常菌群的微生态平衡，促进畜禽增重以及提高饲料转化率效果显著； 化学性质稳定，不残留或极少残留于畜产品中；细菌或寄生虫不易对其产生耐药性，与 其他抗生素不产生交叉耐药性；毒性低，安全范围大，对人畜无害，且有抗癌、抗突变突变等作用10,11，作为一种新型的饲料添加剂，具有广阔的发展前景。 随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品
8、需求日益扩大，为了满足社会需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 12， 灵菌红素是一种天然色素，可以作为纺织工业中的染料，具无毒无公害，具抗菌性能，符合社会需求的纺织品用天然抗菌剂的要求。具有稳定性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等优点，目前正在开发应用当中 13。 灵菌 红素兼有营养保健，抗癌抗菌和天然红色素等多重功能，应用于医疗食品纺织工业都具有独特优势。综之，作为天然红色素， PG具多种独特的药理生理活性，其必将在医药、食品、环保等领域发挥重要作用。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容： 本课题所要
9、研究探讨的是 在体外初步考察灵菌红素对其抗性 。 如：链球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和黄曲霉、镰孢菌、青霉麦角菌等。 及 对有抗性的病原菌，在液体培养基中，进一步测定其最低的抑菌浓度（ MIC）和最低的杀菌浓度 (MBC) 3.2 采取的研究方法、技术路线： 利用金黄色葡萄球菌，大肠杆菌等作为指示菌，采取倍数稀释法确定其最小抑菌浓度MIC和最低的杀菌浓度 (MBC)。采用平皿扩散法（纸片抑菌实验），定性确定其抑菌效果。 3.3 课题的研究难点： 1.灵菌红素作为应用于畜牧业的一种新型的饲料添加剂，现今国内外对其研究还较少，所能借鉴的经验较少。实验不稳定因素较多。 2.黄曲霉，镰孢菌，青霉
10、麦角菌等的获得有难度。 3.4 实验方案 14-21： 1 材料准备 1 1 样品 灵菌红素（实验室粘质沙雷氏菌产），二甲亚砜。 1 2 菌种 黄曲霉、铜绿假单胞菌。 1 1 3 培养基 LB 培养基， PDA 培养基 。 1 1 4 试剂 酵母膏、蛋白胨、琼脂、乙醇、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、土豆、葡萄糖、蔗糖 。 1 1 5 仪器 分液漏斗、真空干燥箱、高压灭菌锅、三角瓶、试管、棉塞、过滤器、针筒、培养皿、恒温控制箱、超净工作台等。 1 2 方法 1 2 1 灵菌红素的提取 转接后放在摇床里培养 48h后取出，摇匀，分别用移液枪移取 2.00ml发酵液于 2ml离心管中， 4 ， 1000r
11、/min，离心 10min，弃上清液，然后用移液枪移取 1ml的丙酮于各个离心管中 ，用 100L枪头搅拌使色素完全溶于丙酮中，再离心，温度为 4 ， 1000r/min，离心 10min。得到灵菌红素丙酮溶液。 1 2 2指示菌菌悬液的制备 取活化好的菌种，调节各菌液浓度至 108 个 /ml，即取两环菌溶于 5ml 无菌水制成菌悬液。再取 0.5ml 个菌液用于涂板。 1 2 3 最小抑菌浓度的测定 用液体二倍稀释法测定各极性段的最小抑菌浓度（ Mininum Inhibitory Concentration MIC）即配置细菌液体培养基按每管 5ml 分装试管，再加入不同量的药液，形成浓
12、度梯度的培养基。接种相同 量（ 0.1ml）的指示菌液，于 37 恒温震荡培养箱中培养 24h,另取不加任何药液的培养基做为空白对照。采用微生物比浊法比较各种抗生素抑菌活性，以无菌液的培养基作为空白，测定 OD600 下吸光度。在以培养基中完全没有细菌生长时的最低浓度为MIC。 1 2 4 最小杀菌浓度的测定 从各段药物的 MIC和高于 MIC的试管中吸取 0.1ml培养物转接于相应的培养基上 37培养 48h，观察菌落的生长情况，无菌落生长的最小浓度即为该药物对该菌株的最小杀菌浓度（ MBC）。 3.5 预期目标： 掌握天然色素的分离纯化的一般方法， 及测定灵菌红素对黄曲霉，铜绿假单胞菌等的
13、抗性及最小抑菌浓度，杀菌浓度。 四、论文进度与安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 2010 年 11 月 1 日 -12 月 18 日： 继续查阅文献资料，同时做好实验室的器材药品的准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日： 对引起家畜疾病的常见细菌和真菌的抗性进行测定。 2011年 4月 20日 -5月 19日： 对实验做初步的总结与归纳，并补充相关实验数据。 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业 论文及答辩。 五、参考文
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