1、毕业论文 开题报告 生物工程 萱草愈伤组织芽分化培养基的筛选 一、 选题的背景、意义 萱草 Hem eroca llis fu lva L. 系百合科 (L iliacea)多年生草本植物 ,以根及根茎入药 ,为我国传统中药“萱草根 (Ra2dix Hemerocallis) ” ,具有清热凉血、利尿通淋的功效 ,用于治疗水肿、小便不利、淋浊、带下、黄疸、便血、崩漏等症 1 - 2 。 又名金针菜 , 原产我国、日本及欧洲南部。萱草叶狭长 ,花呈喇叭形 , 花茎变化大 , 花形各异 , 花期从晚春一直到秋季 , 盛花期可延续几个月。它不仅 供人观赏 , 也可将花蕾作蔬菜供人食用 , 更是被广泛
2、用于绿化工程 , 近年来市场对萱草种苗的需求越来越大。从 2003 年始 , 我站承担了嘉兴市科技局、海盐县科技局下达的“萱草等宿根花卉的组培苗快繁及产业化开发”等科研课题 , 对萱草等品种进行了组培快繁试验研究 , 获得成功 , 到目前已累计生产了红运、金娃娃等 50 多万株的萱草 , 并供应上海、杭州等地 , 在较短的时间内满足客户的需求。 近年来，我国城市环境保护中的绿化建设越来越受到重视，其中急需解决的是绿境植物多样性问题 ， 我国的花卉栽培以前在世界上是有名的，而且花卉 品种甚多 ， 但是由于历史原因，国内现有的花卉生产情况与人民生活水平的提高是不相适应的，因此，引进国外优良花卉品种
3、，可以加快解决我国城市绿化中花境植物品种单一的现状 。 组培法筛选高抗盐植物是现代生物技术之一 ,利用离体再生系统结合选育新品种具有简便、速度快、准确的特点。 近年来研究表明萱草根中含有多种蒽醌类和二氢呋喃 - - 内酰铵类化合物 ,这些成分具有抗菌、抗癌、杀虫等生物活性 3 。萱草不仅具有药用价值 ,还具有蔬菜食用和花卉观赏价值。其花经过加工后是颇负盛名的“黄花菜”、“金针菜” ,营养丰富 ,且具有保健 益寿之功。萱草组织培养的是基于观赏花卉品种的快速繁殖技术的实验研究 4 - 6 ,因此 ,借鉴这些研究成果 ,对药用植物萱草开展了组织培养技术方面前期实验工作 ,期望为进一步研究其药材质以及
4、开发中药功能保健类蔬菜奠定基础。 【 7】 二、 最新研究进展 近年来 ,利用植物组织培养技术 ,成功地获得了许多植物的抗盐培养细胞系 ,并且选择出了水稻、小麦和冰草等植物的耐盐植株。 8该试验对大花萱草抗盐愈伤组织的选择试验表明 ,利用浓度逐级增高的含盐培养基诱导和选择的愈伤组织 ,在盐份浓度较高的培养基上 ,无论生长率还是存活率均明显 提高。抗盐性大小与在含盐培养基上培养的时间长短有关。愈伤组织的这种抗盐性具一定程度的稳定性。抗盐变异产生的原因可能有两个方面 ,一是在低水平选择压力下 ,可能产生了生理适应的细胞 ;二是在高水平选择压力下经长时间选择培养 ,可能产生遗传上变异的细胞。这种遗传
5、上发生的变异一般是稳定的 ,该试验通过大花萱草组培苗的抗性培养基上抗性比较 ,证明了盐胁迫与繁殖系数、生物产量有一定的相关性 ,并确定的适合的盐筛选浓度 ,并确定脯氨酸能反应出组培苗在盐胁迫过程中的生理变化。 9通过组织培养技术可以快速生产出发育健壮的金娃娃萱草苗。其 诱导愈伤组织和形成丛生芽的最佳外植体为花蕾 ; 最佳诱导和继代培养基均为 MS+ 6-BA 1. 0 mg/ L+ KT1. 0 mg/ L+IBA0. 5 mg / L, 最佳生根培养基为 1/ 2MS+ NAA 0.1 mg / L; 生根试管苗根系长至 1. 5 cm 以上时 , 移栽成活率高达 90. 0%以上。【 10
6、】 自然界的萱草一般采用分蘖等无性繁殖方式进行增殖 , 但由于其速度慢，一般一株萱草每年仅可繁殖 4-5株，因而难以适应市场商品化生产的需求 , 利用组织培养技术快速繁育试管苗，是一项目前被广泛应用于花 卉生产的技术 ,虽然组织培养技术快速繁殖试管苗存在生产成本高、试管苗出现变异植株等问题，但是采用组织培养繁殖可以提高繁殖倍数，而且可以打破季节局限，加快繁殖速度，实现工厂化育苗 , 因此，组织培养繁殖技术在挽救濒危稀有植物品种、由于引种植物品种母本植株少而急需扩繁以增加生产规模等方面发挥着巨大作用。前人对于萱草组织培养的研究，仅见有少量简短的报道 【 11-14】 而未见到有关观赏型大花萱草的
7、工厂化扩繁方面的报道 , 本文就 9 种观赏型大花萱草外植体的选择和愈伤组织的诱导进行了研究，以期为合作企业提供相关环节的技术参数 ，为企业进一步大规模组织培养扩繁萱草提供技术指导。 【 15】 三、研究的基本内容 通过设计所得的实验方案，确定合适的实验方法。将萱草愈伤组织在选择性培养基上进行增殖，进行目的筛选，保存后进行一系列的筛选，对筛选出来的培养基进行性能鉴定和成分鉴定，确定所选培养基。 四、拟采取的研究方法（技术路线）、研究难点及预期达到的目标 1 技术路线 1.1外植体的选择 选取以上各萱草品种的叶片（切成 2 3cm大小）、茎尖、根（侧根切成 20.5cm长，主根横切为半径 1 0
8、.5cm的园片）和子房（横切为 3段），经流水冲洗，70%乙醇浸 2-3遍 后，蒸馏水冲洗 2-3次，再用 0.1%HgCl2灭菌 8-10mins， 无菌水冲洗 2-3次后，进行接种 。 1.2不同萱草品种愈伤组织诱导培养基的筛选 选用 MS培养基作为基本培养基，同时参阅前人有关萱草及其同属、同科植物的愈伤组织的培养基配方 【 16-19】 设计了 12种激素组合进行初步试验，从中筛选出适合各品种愈伤组织生长的最适激素组合 。 2.研究难点及预期达到的目的 用萱草嫩茎作为外植体在适宜的诱导培养基上培养 , 可以对其进行快速繁殖 ,嫩茎的取材和消毒都十分方便 , 而且在取材过程中不损耗母株 ,
9、 适于 引进品种的规模化繁殖与快速生产。在红宝石萱草的继代增殖培养中 , 由于萱草再生植株的形成过程不同 ,根据不同的植株体 ,选用不同激素浓度的培养基 ,以达到最好的增殖分化效果。在培养环境中温度是关键因素 ,低温培养停滞分化 ,高温培养玻璃化 ,在 25 26 和 26 27 条件下能达到预期的分化效果。在无糖基质中培养生根 , 可明显减少常规组培技术中的污染和移栽步骤 , 而且提高了成苗率。无糖培养体系要求增加培养环境 CO2 浓度和光照强度等环境因子的调节来调整植株生长 【 20-21】 对培养室硬件设施的要求较高 , 在规模化种苗生 产中有一定的局限性 . 红宝石萱草的无糖生根培养采
10、用室内生根设施培养方法 ,在设施中空气中的 CO2 浓度在 900 1 000 mg/ L ,平均光照强度 4 000 6 000 lx ,种苗的成苗率达 90 %以上。 【 22】 五、论文详细工作进度和安排 1. 2010 年 7 月 1 日 2010 年 10 月 31 日：完成资料的检索和整理及汇总。 2. 2010 年 11 月 1 日 2010 年 12 月 31 日：完成开题报告及论文翻译工作。 3. 2011 年 1 月 25 日 2011 年 4 月 30 日：基本完成论文所需的实验工作。 4. 2011 年 5 月 1 日 2011 年 5 月 31 日： 完成论文的写作以
11、及准备答辩。 五、主要参考文献 【 1】 张铁军 . 萱草根的原植物考证 J . 中国中药杂志 , 1993, 18(9) : 515 - 517 【 2】 任涛 ,张铁军 . 中药萱草根的采收期研究 J . 中草药 , 2000,31 (3) : 222 - 224 【 3】 杨中铎 ,李援朝 . 萱草属植物化学成分及生物活性研究进展 J . 天然产物研究与开发 , 2002, 14 (1) : 93 - 97 【 4】 李艳梅 ,王桂兰 ,陈超 ,等 . 大花萱草新品种“红运”快繁体系的建立 J . 河南农业科学 , 2006, (08) : 120 - 122 【 5】 王汉海 ,程贯召
12、 ,杜延飞 . 大花萱草新品种“金娃娃”的组织培养和快速繁殖 J . 植物生理学通讯 , 2002, 38 (5) : 458 【 6】 王晓娟 ,沈延松等 . 萱草 (Hemerocallis hybrida)再生植株过程中根的 J . 复旦大学 (自然科学版 ) , 2002, 41(1) : 40 432553 【 7】 刘长利 ,崔俊茹 . 萱草组织培养及植株再生的研究 J . 首都医科大学中医药学院2007, 25(12): 2552-2553 【 8】 沈银柱 ,刘植义 . 诱发小麦成熟胚愈伤组织及其再生植株抗盐性变异的研究 J . 遗传报 ,1993 ,20(3) :253226
13、1. 【 9】 张伟丽 , 刘凤民 , 许旭丹 . 组培法筛选高抗盐大花萱草品种的初步研究 J. 仲恺农业工程学院生命科学学院 ,2009(11) :184 186 【 10】 杨永花 . 金娃娃萱草组织培养技术研究 M. 兰州市园林科学研究所 ,2003, 12:0033-0035 【 11】 黄济明。几种花卉的组织培养 J .植物生理学通讯 .1983（ 5）： 44-48 【 12】 倪新，马毓 .多倍体萱 草的组织培养及其繁殖 J 园艺学报 1984,11(3):202-205 【 13】 杨乃博 .杂种大花萱草的试管繁殖 J 植物生理学通讯 .1985,5:39 【 14】 王汉海，
14、程贯召，杜延飞。大花萱草新品种“金娃娃”的组织培养和快速繁殖 J 植物生理学通讯。 2005,38（ 5）： 458 【 15】 王晓娟，陈家宽 . 大花萱草不同外植体诱导愈伤组织的比较研究 J. 兰州大学草地农业科技学院 .2005,9(3)； 242-246 【 16】 马勋。大花萱草 J 植物杂志。 1996,5:17 【 17】 黄济明 .几种花卉的组织培养 J .植物生理学通讯 1983（ 3）： 44-48 【 18】 倪新，马毓。多倍体萱草的组织培养及其繁殖 J .园艺学报。 1984.， 11（ 3）： 202-205. 【 19】 杨乃博。杂种大花萱草的试管繁殖 J .植物生理学通讯。 1985,5： 39 【 20】 徐振华 ,王学勇 ,李敬川 ,等 . 试管苗瓶外生根研究进展 J . 中国农学通报 .2002 ,18(4) :84287. 【 21】 何云芳 ,余有祥 ,裘丽珍 ,等 . 金线莲组培苗的试管外生根和大田移栽技术 J . 浙江林业科学 ,1998 ,18(2) :22225. 【 22】 王 蓉 , 杨 彬 , 李秀霞 .“红宝石” 萱草的组织培养快繁技术研究 . 新疆农业职业技术学院 . 2009(9) :173 175
