1、毕业论文 文献综述 生物工程 天然色素生产菌的诱变选育 摘要 ： 本文对灵菌红素的一些生理活性作了简要的概述，简述了有关诱变育种的相关知识，同时列举了几种天然色素生产菌株的诱变选育技术，并且对微生物的诱变育种新技术作了简单介绍。 关键词： 灵菌红素 诱变选育 高产菌株 引言 ： 灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，是一些放线菌、沙雷菌及其他细菌的次级代谢产物，具有多种生物学活性 ,如自身免疫抑制 ,抗肿瘤 ,抗细菌 ,抗疟疾 ,抗真菌和抗原生动物等，同时他还是一种天然色素，因而成为研究热点。研究利用合适的诱变育种 技术筛选出高产灵菌红素的菌株，并对其发展趋势作一综述。 1.灵菌红素的
2、理化性质 灵菌红素（ prodigiosins， PG）是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigiosin,prodigiosin 25-C，metacycloprodigiosin（ MP） desmethoxyprodigiosin 和 uncedylprodigiosin（ UP）等是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 1,2，具有 抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等活性 3-7。 2.诱变选育技术获得高产色素生产菌株 2.1 诱变选育定义 诱变育种
3、是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 2.2 诱变剂的种类和选择 A.诱变剂种类的选择 物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦 耳）、 X 射线（库仑 /千克）、 射线、 射线、 射线和超声波等；化学诱变剂包括 甲基磺酸乙酯（ EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考
4、虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。 采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。并结合自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。 B、最适诱变剂量的选择 诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占
5、有最大比例，这样可减少以后的筛选工作。 要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、 x 射线及乙烯亚胺等诱变 剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为9099.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为 70% 75%，甚至更低 (30% 70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌
6、株更是如此。 化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、 pH 等）。物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水 等），以达到最佳的诱变效果。 2.3 诱变处理 A、 不同诱变处理方法 （ 1）紫外线照射 紫外线诱变育种的原理是：紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136 300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在 265nm 处，对应于功率为 15W 的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能
7、量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱 氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起 DNA 分子结构变化而造成的。这种变化包括 DNA 链的断裂， DNA 分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于 DNA 的变化起主要作用。 不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡 率的曲线
8、，这样就可以选择适当的照射剂量。 一般以照射后微生物的致死率在 90%99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率 70%75%甚至更低 (30%70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。 （ 2） 等离子输入 等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自 20 世纪 60 年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于 生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于 1986 年开创的。低能离
9、子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与 射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高 LET 粒子，有 Braag 峰，具有较 强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的
10、诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。 （ 3） CO60 照射 CO60属 射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变 DNA 结构。直接的效应 是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖 -磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于 DNA 分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸
11、变。不同的微生物对 C060 的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。 一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在 410 万伦琴，或者采用能使微生物产生 90 99死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂 ，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。 B、不同诱变处理方式 单一因子处理：采用单一诱变剂处理，可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。 复合因子处理：指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。主要有：两个以上
12、因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一种诱变剂连续重复使用；紫外线复活交替处理。 3.诱变实例借鉴 目前诱变选育运用较多的还是紫外线诱变由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。 孙文红，高玉荣在紫外诱变选育红曲红色素高产菌株的研究中运用了紫外线照射并确定了合适的诱变剂量： 2.5min 为最佳诱变时间 7。王伟平，吴思方等在利用复合诱变红曲霉选育红色素高产菌株中同样采用了紫外线 氯化锂复合诱变技 8这种方式为上诉提到的复合因子处理，是一种比较流行新兴的诱变。陶金莉等在选育高产灵菌红素沙雷氏菌株是运用的是紫外线 氯化锂复合诱变
13、技术确定的紫外照射时间为 20s。实验中在该照射时间下，添加氯化锂发现对致死率没有多大影响，但是 正突变率有所提高 9-11。 还有利用微波法选育红曲霉菌种的，左秀凤等人用 50W 的微波照射获得高产菌株，研究了微波照射时间与正突变率，死亡率的关系，从而确定了适合的诱变剂量。 12 此外有运用离子注入的方法来获得诱变菌株：孙洁 ; 吕加平 等人利用 N+注入诱变高自溶度的乳酸菌突变株 ，诱变的效果也是非常好的。 诱变选育的例子举不胜举，但是从这些例子当中可以总结出诱变选育的基本流程步骤和一些方法。 4.诱变育种新技术 4.1 离子注入诱变技术 离子注人对生物体的诱变作用就是荷能离子束本身所具有
14、的质量、能量和电荷 对生物体所产生 的直接作用。其中包括能量沉积、质量沉积、电荷中和和交换、电子溅射、离子溅射等作用。同时，离子注入用于生物体诱变，可以在损伤轻的情况下获得较高的突变率和较宽的突变谱 13.14。 4.2 激光诱变育种 激光诱变育种是 20 世纪 70 年代兴起的一种诱变技术。国内外利用激光诱变微生物已做了不少 研究工作。激光诱变技术在微生物上应用还是刚刚起步。但已取得了不少成绩。并在此基础上得出了一些规律性的认识：其一 ，对 同一微生物而言，任何一个可见光波段都可以产生生物刺激作用：不同波长的激光辐照微生物产生最 大生长刺激作用所需剂量不同：特定激光辐照微生物产生生长刺激作用
15、与该激光的辐照强度有密切关系。其二，对不同微生物而言。用同一波长激光辐照产生 的生物效应有较大差异。另外，激光诱变还受季节变化和细菌的生理状态的影响。 15 4.3 空间诱变 空间诱变育种又称航天育种或太空育种。是指利用返回式卫星、飞船或高空气球将生物材料搭载到太空，利用太空特殊的环境 ( 空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素 ) 对生物材料进行诱变，再返回地面选育新种质、新材料，培育新品种的生物育种新技术。空间环境的主要特征是空间辐射、 微重力、超真空和超净环境等。 4.4 其他新型诱变技术 近些年，随着人们对育种技术的不断探索和追求。有许多新的育种技术相继应用于实践。除前面阐述的空间
16、诱变、离子束诱变和激光诱变外，还有微波、双向复合磁场、红外射线和高能电子流等新诱变技术相继应用于微生物育种中。其中高能电子流是较强的电离辐射，是抗生素生产中常采用的诱变源这些诱变源单独对微生物进行诱变时效果不甚理想。但与其它诱变源进行复合诱变。则能起到很好的诱变效果，因此从某种意义上称这些诱变源为 增变剂 。 此外 ，离子束微生物诱变育种多用的是 Na+ 。今 后应加强其它离子应用的研究相信随着相关研究的深入。这些新型物理诱变技术必将在工业微生物诱变育种过程中选育出更多的优良菌株，探索新的诱变技术的研究将具有广阔的发展前景 16 。 参考文献： 1 Shieh W Y, Chen Y W, C
17、haw S M, et al. A red, facultatively anaerobic, marine bacterium isolated from sea waterJ.Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53:479-484. 2 Pandey R, Chander R, Sainis K B. A novel prodigiosin-like immunosuppressant from an alkalophilic Micrococcus sp.J.Int Immunopharmacol, 2003, 3(2): 159-167. 3 刘同军 ,
18、杨海龙 ,唐华 .灵菌红素的研究进展 J.食品与药品 .2007,9(8):47-51. 4 王春玲 .灵菌红素生物合成与分离纯化研究 C.合肥工业大学 .2007(5):35-40. 5 Nakashima T, Kato Y, Yamaguchi K, et a1. Evaluation of the anti-Trichophyton activity of a prodigiosin analogue produced by -proteobacterium, using stratum corneum epidermis of the Yucatan micropigJ.Japane
19、se Society of Chemotherapy and The Japanese Association for Infectious Diseases.2005,11:123128. 6 Cang S, Sanada M, Johdo O, et a1.High production ofprodigiosin by Serratia marceseens grown of ethanolJ.Bioteeh Len.2000,22:1761-1765 7孙文红 ,高玉荣 .紫外诱变选育红曲红色素高产菌株的研究 J.酿酒 .2008,35(1):75-78. 8王伟平 ,吴思方 . 复合
20、诱变红曲霉选育红色素高产菌株 J. 湖北工学院学报 J.2003,18(4):5-9. 9陶金莉 , 沈亚领 . 产灵菌红素沙雷氏菌的诱变育种 J.微生物学报 .2004.31.(2) 10曾春民 ,林国强 ,沈鹤琴 .中国海洋药物 .1996,2:57. 11陈代杰 , 朱宝泉 . 工业微生物菌种 选育与发酵调控技术 . 上海科学技术文献出版社 .1994 12左秀凤 ,刘隽 ,杨莉 . 微波法选育红曲霉菌种发酵生产生理活性物质的研究 .河南职工医学院学报 . 2009 .21.(05) 13 余增亮 .离子束生物技术引论 .安徽科学技术出版社 , 1998-12-1 14 余增亮 ,邱励俭 ,霍裕平 . 离子注入生物效应及育种研究进展 J安徽农业大学学报 , 1991,(04) . 15 向洋 ,吴建华 ,陈绍荣 . 激光辐照米曲霉菌株的生理生化研究 .1994 .5( 2):8 7 9 0. 16汪杏莉 ,李宗伟 ,陈林海 ,刘晓波 ,谢慧波 .工业微生物物理诱变育种技术的新进展 .生物技术通报 .2007.2.
