1、毕业论文 文献综述 生物工程 多酚氧化酶活性测定及控制 1 前言 多酚氧化酶（ PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后， PPO 所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 多酚氧化酶（ PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使 PPO 与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制 PPO 活性取决于抑制剂的 性质和浓度、底物的可利用性、 pH 值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均
2、已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬 PPO 活性的研究。 2 主题部分 2.1 从果蔬中提取 PPO（以莲藕为例） 2.1.1 丙酮法 （丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加 4 倍量预冷至 18。 C 的丙酮 (w v 为 1： 4)捣碎，搅拌 3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉 O 5 g，加入 0 2 mol L， pH 为 5 4 的预冷磷酸二氢钠柠檬酸缓 冲液 20ml，搅拌 3min， 8 000r min 离心 10min，所得上层清液即为粗酶液。 【 1】 2.1.2 匀浆法 （匀浆法提取
3、的酶液没有活性） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入 0 05mol L， pH5 4 的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 (含5的 PVPP)，料液比为 1： 2 2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入 0 05mol L， pH5 4 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液 (W V 为 1： 1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并， 8 000r min 离心 10rain，所得上清液即为粗酶液。 【 2】 2.2.3 匀 浆浸提法 （匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究） （ 1） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入 0 05mol L， pH5 4 的预冷磷酸氢二钠柠檬酸缓
4、冲溶液 (含 5的 PVPP)，料液比为 1： 2 2，捣碎，搅拌， 4。 C 下静置 4h，抽滤，所得滤液即为粗酶液 。 【 3】 （ 2） 每个处理准确称取莲藕 20 0 g，切碎后加入 50 0 mL 磷酸缓冲溶液 (pH6 5)冰浴研磨后，低温下离心 5 mill(3000 r rain)，取上清液得粗酶液。 【 4】 （ 3）新鲜藕肉去皮打浆后，采 用 pH 值为 5 4 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 (含 5 PVPP 和10 NaCl)提取，料液比为 l： 2 2，置 4冰箱中浸提 4h，提取的莲藕 PPO 活性最大。 【 5】 2.2 PPO的分离纯化 取 10 下贮藏到第 8
5、天的鲜切莲藕片组织 250 g，首先采用液氮速冻，按 1： 2 质量比例加入经过预冷 (4 )的 0 1 mol L、 pH6 8 的磷酸缓冲液 (内含 5 oA 的 PVP)，在高速组织捣碎机上捣碎，然后于 4 下浸提 2 h，用 4 层脱脂纱布过滤，滤液于 10 000 r min、 4 下离心 15rain，上清液即为多酚氧化酶粗酶 液。向粗酶液中边搅拌边加入固体硫酸铵至 30饱和度， 4 下静置 2 h，于 10 000 r rain、 4 下离心 10 min，弃沉淀，继续向上清液中加入硫酸铵至 70饱和度， 4 下静置过夜，然后于 10 000 r min、 4 下离心 15 mi
6、n，弃上清液，将沉淀用尽量少的 0 1 mol L、 pH 值为 6 8的磷酸缓冲液溶解，得到酶的提取液。然后将酶提取液用 0 1 mol L、 pH 6 8 的磷酸缓冲液透析过夜，中间换透析液 2 次，然后用 amicon 超滤杯浓缩至 10 mL。 【 6】 2.3 PPO 活性的测定 2.3.1消光值法 测定 PPO活性 在 l cm 比色皿中，加入 1 5 mL pH7 0 的磷酸盐缓冲溶液，再加入 O 1 mol L 邻苯二酚溶液 1 0mL，迅速加入 PPO 粗酶液 0 5mL，混匀。在 420nm 波长处测吸光度，每 10 s 记录 1 次吸光度 (0 )420)随时间的变化值。
7、最后确定 30 s 和 l min 时检测，在室温下测定 PPO 的活性 (27 )，测定 OD420 值。以最初直线段的斜率 ( OD t，卜时间， min)计算酶 活力。一个相对酶活性单位定义为：该酶液在测定条件下每分钟引起吸光度值改变 0 001 所需的酶量。 PPO 相对活性 =各处理组吸光度值同组最佳处理组吸光度值 100。 【 7】 2.4 抑制剂对 PPO 活性的控制 2.4.1 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制 将硫代硫酸钠 (Na2S2O3)、硝酸银 (AgNO3)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)作为抗氧化剂来防止核桃组培褐变 ,分别将其设定为 X1、 X2、 X3。
8、按照三元二次回归组合设计 ,得到数学模型来达到精确控制褐变的目的 ,并且为核桃组织培养过程中如何控制褐变提供理论依据。结果显示：在抑制 PPO 活性方面 ,PVP 作用最明显 ,其次是 Na2S2O3、 AgNO3。 【 10】 2.4.2纯化的莲藕多酚氧化酶 (PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化 园二色谱分析表明莲藕 PPo 主要含有一螺旋和一折叠结构。与抑制剂作用后，莲藕 PPO 活性显著降低，同时伴随其二级结构中 -螺旋结构明显减少，表明莲藕 PPO 的活性中心可能位于 -螺旋结构中。荧光分析表明，莲藕 PPO 与邻苯三酚 (pyrogallic acid， PA)作用后，酪
9、氨酸残基荧光强度略有降低，入 max 位移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低，入 max 红移 2 nm；而与莲藕多酚 (Lotus root polyphenol， LRP)作用后，莲藕 PPO 分子中酪氨酸 (Tyr)和色氨酸 (Trp)残基荧光强度显著提高，且其最大发射波长分别蓝移 6nm 和红移 5nm。当加入异 Vc 钠后， Tyr 和 Trp 残基最大发射峰显著红移，说明 Trp 和防残基位于一定的疏水环境对维持 PPO 催化活性的优势构象至关重要。 【 11】 2.4.3 磁场对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响 以邻苯二酚为底物 ,莲藕 PPO 褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单
10、底物酶促反应动力学 ,Km为 0.775mol/L,Vmax 为 11.150U/min。 Vc 对 PPO 有较强的抑制作用 ,反 应动力学参数 Km 为0.081mol/L,Vmax 为 3.243U/min,呈现反竞争性抑制 ,表现为褐变出现滞后 ,随 Vc 浓度的增大滞后时间逐渐增长 ,且呈现 S 型趋势 ,并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下 ,随着处理时间的变化 ,PPO 活性呈现波动性。 3.17A/m 磁场强度下处理 4h 的酶液其反应动力学曲线表现为 S 型 ,并建立了相应的反应方程。 【 12】 2.4.4 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响 南湖菱 PPO 催化反
11、应的最适温度为 30 0C ,最适 pH 6.5 ,最佳吸收波长 420 nm ,最大反应速度Vmax=33.67 unit/min，米氏常数 Km= 0.286 mol/L。在 3 种抑制剂抗坏血酸、 EDTA 和柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为 0.3 mmol/L。 【 13】 2.4.6 二氧化氯 (ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶 (PPO)的影响 ClO2 具有消毒、杀菌、防腐、漂白、除臭等多种功效，是世界卫生组织 (WHO)和世界粮农组织(FAO)向全世界推荐的 A1 级广谱、高效、安全化学消毒剂。 【 14】 用 100mg L 浓度的 ClO2 处理鲜
12、切藕片 5min、 10 min、 15 min 后，在贮藏期间能 抑制 PPO 的活性，而 10 mg L 浓度对 PPO 的活性不起抑制作用反而促进了 PPO 的活性 100 mg L ClO2 处理鲜切藕片 10 min 抑制 PPO 的活性效果最好。 【 15】 2.4.7 底物浓度、 pH、温度对鲜切莲藕中 PPO酶的影响 鲜切莲藕的 PPO 活性最适反应底物浓度为 0.02 mol/L，并且底物浓度与 PPO 活性的关系完全遵循 Michealis-Menten 的酶促动力学性质。 PPO 最适 pH 值为 7.O， pH 对 PPO 的影响显著，当 pH4.0时， PPO 活性显
13、著下降，可见，调节 pH 值可有效地抑制 PPO 活力。 PPO 活性的最适温度为 35，在 0 -5之间，莲藕的 PPO 活性受到明显的抑制。 【 16】 2.4.8 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 添加抑制剂可使莲藕 PPO 反应速率发生变化。苯甲酸 I 可与酶 E 结合生成无活性的二元复合物EI，减小可供邻苯二酚进攻的游离酶 E 的浓度，也就降低了酶一底物 ES 的浓度，而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率 ymax，从而破坏了莲藕 PPO 的正常催化氧化反应系统 【 12】 。 2.4.9护色处理对多酚氧化酶活性的影响 对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为 EDTA
14、浓度为 0.25% , Vc浓度为 0.1%、草酸浓度为 0.25%半胱氨酸浓度为 0.7%、处理时间为 8min。 【 17】 采用 0 15柠檬酸 +0 05 D 异抗坏血酸钠 +1 0氯化钠作组合护色液护色 40min 可以起到很好的抑制莲藕的酶促褐变的作用。 【 18】 3 展望 莲藕中酚类物质的氧化与其褐变程度密切相关，但莲藕中主要酚类物质的种类和在褐变中的主要作用，以及与 PPO的作用方式等都有待于进一步研究。目前对莲藕色素前体物质的报道较少，因此深入分析莲藕中酚类物质的组成、结构、性质，从而阐明其与莲藕贮藏保鲜和加工质量的关系，具有重 要的理论意义和实用价值。 参考文献 1 潘永
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