1、 毕业论文 文献综述 生物工程 甘草酸单钾盐制备工艺研究 1 前言 甘草 (Radix glycyrrhizae) 为豆科植物甘草 (Glycyrrhiza uralensisFisch) 、胀果甘草(Glycyrrhiza inflataBat.)或光果甘草 (GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和茎 ,是极为重要的一味中药材。甘草中主要含有甘草酸 (glycyrrhizic acid)、甘草次酸、黄酮、生物碱、氨基酸等化学成分 ,具有广泛的生理活性。甘草酸是其中最为重要的化学成分 (其含量最高可达 14%),也是研究得最早、最多的化学成分。目前，甘草酸已被广泛应用于食品、化妆品
2、和医药等行业 ,用作甜味剂、美容护肤品以及用于解毒、消炎、抗过敏、抗溃疡、镇咳、抗肿瘤和防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病 13。因此 , 甘草酸被列为重要的精细化工产品 ,国内外需求量都很大。近年来 ,甘草药材由于遭到过度采挖 ,资源急剧减少 ,保护甘草资源已迫在眉睫。国内有些生产厂家所用工艺落后 ,也不同程度地造成资源的浪费。 甘草酸单钾盐为甘草中主要有效成分甘草酸的单钾盐，甘草酸在水溶液中溶解度低，所以常把它制备成甘草酸单钾盐，国内外曾对其活性进 行了广泛的研究。据报道 ,其有消炎 、保肝 、抗溃疡 、抗过敏 、抗病毒等多种药理作用。 2 甘草酸单钾盐制备 2.1 甘草酸粗品的制备 2
3、.1.1 传统提取方法 从甘草及其制品中提取甘草酸的传统方法包括室温冷浸法、渗滤法、煎煮和热回流法以及索氏 (Soxhlet)提取法。 室温冷浸法是在室温条件下 ,将甘草粉末加入到适当的容器中 ,加入适当比例的水、氨水或醇等溶剂浸提 ,其提取的效率较低 ,时间相对较长 ;渗滤法需要使用特制的渗滤设备 ,不断加入溶剂 ,使之与渗出液一直保持一定的浓度差 ,提取效率较冷浸法高 ,但与冷浸法 一样提取时间较长 ,溶剂消耗量较大 ;煎煮和热回流法是通过加热处理 ,增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度 ,热回流法避免了乙醇等低沸点溶剂的挥发损失提取效率较高 4。 索氏 (Soxhlet)提取法又称连续回流提
4、取法 ,其利用索氏提取器对甘草粉末进行提取 ,加热蒸发的溶剂经冷凝后又回到样品管中 ,经约 10 个循环后 ,基本可将甘草中的甘草酸提取完全 ,提取效率较高 ,同时节省了溶剂 ,但时间相对较长。 2.1.2 超声强化提取法 (ultra sound wave extraction,UE) 超声波提取技术主要是利用超声波产生的强烈 空化效应加速植物有效成分的浸出提取，另外它产生的机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等次级效应，也能加速提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。赵茜等 5以氨水为溶剂研究了超声介入强化提取甘草酸的作用效果 ,通过对施加超声场的功率、温度、浸渍时间、 pH 值以及
5、搅拌速率等参数进行了研究 ,认为与未施加超声场的传统方法相比 ,超声辅助提取可显著缩短提取时间 ,并获得较高的提取率。 2.1.3 微波辅助提取法 (microwave assisted extraction,MAE) 微波萃取 (MAE)技术是利用微波提高 萃取率的一种新技术，其原理是在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进人到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。潘学军等 6 研究了微波辅助提取甘草酸的条件 , 发现当微波提取 45 min,w( 乙醇 )=50%60%,w(氨水 )=1%2%,液
6、固比为 10 1(mL/g)时 ,甘草酸的回收率与热回流法、索氏(Soxhlet)提取法、室温提取法等传统的提取方法相当 ,但 MAE 比传统方法更节约时间和溶剂 ,效率更高。 2.1.4 超临界流体提取法 (supercritical fluid extraction,SFE) 原理是通过调节压力和温度 ,使物质的气相和液相消失 ,形成超临界流体 ,溶解力和液体相似 ,但扩散系数接近气体 ,因此 ,可对中草药中的有效成分进行选择性提取 ,提取效率较高 ,提取液的杂质少 ,提取时间较短。通常使用的超临界流体为 CO2,其临界温度为 31.03 ,不需要加热就能将溶质和溶剂分开 ,无毒、高效、价
7、廉 ,并具有灭菌功能。李巧玲等 7研究了超临界流体技术萃取甘草酸的各种因素 ,并与冷浸法、热提法、超声波法提取甘草酸作了比较研究 ,结果表明 SFE 法的萃取率高于上述 3 种方法 ,而萃取周期大大缩短 ,并且节省提取溶剂。 2.1.5 负压空化法提取甘草酸 近年来 ,由付玉杰等 8人为甘草酸的提取研究出了一种全新的提取工艺 负压空化法提取工艺 ,它是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动 ,造成样品颗粒细胞壁快速破裂 ,加速了细胞内物质向介质释放、扩散和溶解 ,促进提取过程。由于在较短时间内负压空化的机械振动更为激烈 ,使得负压空化提取甘草酸的收率较超声法高 ,研究表明负压空化提取法对
8、甘草酸的提取收率是超声提取法的 1.2 倍、索氏提取法的 1.7 倍 ,同 时负压空化提取法具有提取温度低、溶剂用量少、时间短和纯度高、提取效率高、易于操作的特点。适于工业化生产 ,为中药提取现代化提供了一种新的方法和手段。 2.1.6 超高压提取法 超高压提取法是在常温或较低温度 (通常低于 100 )的条件下，对原料液迅速施加 100一 1000 MPa 的流体静压力。保压一定时间，溶剂在超高压作用下迅速渗透到原料内部。有效成分溶解在溶剂中，并在短时间内达到溶解平衡，然后迅速卸压，在超高渗透压差下，有效成分迅速扩散到组织周围的提取溶剂中。郭文晶等人应用超高压提取法提取甘草酸，利用正交设 计
9、方法确定最优提取工艺 :压力 400Mpa、保压 3 min、固液比 1;10。通过此工艺，甘草酸粗品收率可达 11. 71%，粗品中甘草酸含量达 73. 09%。超高压法提取甘草酸具有提取率高，提取时间短，节约溶剂，提取物杂质少，能耗低，工艺简单等优点，是一种高效、节能的新方法。 2.2 甘草酸提取溶媒的选择 中药有效成分的提取 ,无论采用何种技术 ,提取溶剂的选择都很重要。根据甘草酸溶于热水和热的稀乙醇 ,不溶于无水乙醇和乙醚 ,遇酸沉淀等理化性质和实际工艺要求 ,提取的溶剂主要有水、稀氨水、稀醇和氨性醇溶液 9,10。 2.2.1 水提法 水提法操作是最常用的方法 ,溶剂的成本相对较低
10、,对环境安全 ,操作较为简单 ,适于工业化生产和甘草酸粗品的提取。但该方法由于提取液富含糖及蛋白质 ,易被细菌或真菌污染而发霉 ,由于富含蛋白质等高分子成分 ,黏度大 ,且水的沸点高 (100 ),浓缩较费时间 ,收率比较低。 2.2.2 稀氨水提取法 提取溶剂若采用稀氨水 (质量分数为 0.5%5%),则可与甘草酸形成铵盐而增加其水溶性 , 使提取效率提高 ,但提取过程中会有氨气逸出 ,容易造成环境污染。 2.2.3 稀醇提取法 稀醇 (甲醇或乙醇 ,质量分数 50%70%)溶液对甘草酸的溶解性较好 ,对植物细胞组织的穿透性也较强 ,多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀 ,因此提取液的杂质较少
11、 ,提取效率较高 ,不容易发霉 ,但成本相对较高。 2.2.4 氨性醇提取法 结合氨水提取和稀醇提取的特点 ,采用氨性醇提取甘草酸的效果最佳 ,收率最高 ,可比水提法提高 3 倍以上 ,从而节约资源、降低成本、并且避免了糖类、淀粉等水溶性杂质的混入 ,便于精制 , 适于实验室研究的定量测定 6,11。但不同的研究者由于研究的目的不同 ,氨醇的比例并不一致 ,如黄维安等认为采用 w(氨 )=0.3%+w(乙醇 )=60%提取较好 12;潘学军等采用w(乙醇 )=60%+w(氨水 )=1%+水 7;王巧娥等认为 w(乙醇 )=10%+w(氨水 )=0.5%提取效率最高13。章玉华等 11比较了各种
12、溶剂提取甘草酸的优缺点 (见表 1),发现水提法和稀氨水提取法比较适合工业生产 ,而氨性无水乙醇提取法则比较适合实验室提取高纯度的甘草酸。 2.2.5 高速逆流色谱技术提取纯化甘草酸 高速逆流色谱 (HSCCC)的原理是互不相溶的两相溶剂在聚四氟乙烯管内具有单相流体动力平衡性质 ,高速运转时一相溶剂作固定相 ,另一相作流动相。由于样品中各组 分在两相中分配能力不同 ,在管中移动速度也不同 ,因而能在溶剂间反复分配进行分离 ,纯化、回收率高、运行成本低。最近 ,Jiang 等 14采用 HSSCCC 以 V(醋酸乙烷 ) V(甲醇 ) V(水 )=5 2 5 组成的两相溶媒一步法从甘草根中提取纯
13、化甘草酸 ,下相作流动相洗提 ,该方法提取率为95.2%、纯度为 96.8%。由于不使用固相载体作固定相 ,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。 HSCCC 技术不仅适用于粗提物去杂 ,还适用于最后产物的精制、纯化。 2.3 纯化甘草酸的方法 由于应用上述方法提取的甘草 酸粗提液中除含有甘草酸外 ,还含有许多杂质 ,如还原糖、胶质、蛋白质、淀粉、黄酮类等物质 ,要获得甘草酸纯品需要进一步除去这些杂质。目前 ,精制甘草酸的方法主要有酸沉反复结晶、双水相萃取、树脂吸附、超滤膜分离等 15。 2.3.1 反复结晶法 甘草酸粗提液加酸沉淀 ,再经乙醇或丙酮溶提 ,氨化成盐析出 ,
14、再经活性炭脱色 ,反复结晶得到甘草酸纯品。 2.3.2 双水相萃取技术 (aqueous two phase extraction,ATPE) 双水相萃取技术是利用被提取物质在不同的两相系统间分配行为的差异进行分离。与传统 水煎醇沉相比 ,ATPE 操作方便 ,条件温和 ,时间短 ,易于工程放大和连续操作。霍清等 16通过对 6 种双水相体系中不同种类盐分相能力及不同种类有机溶剂的分相情况进行研究 ,确定了萃取甘草酸的最佳双水相体系为乙醇 /磷酸氢二钾双水相体系。此体系收率可达 98.3%,且溶剂价廉、低毒、易挥发、易回收 ,操作中制备甘草酸单铵盐。 2.3.3 吸附树脂法 (absorpti
15、on resin,AR) 吸附树脂法包括离子交换树脂和大孔吸附树脂两种方法。其原理是利用树脂对甘草酸的选择性离子交换或树脂对甘草酸及杂质的吸附能力差异 ,从甘草 酸粗提液中选择性吸附甘草酸 ,然后用稀醇溶液从树脂柱中洗脱下来 ,从而分离纯化甘草酸。由于离子交换树脂处理量小 ,需引入可进行交换的酸性或碱性基团 ,提取效率较低。刘倩 17等考察了 4 种大孔树脂后 ,优选 AB-8 树脂进行甘草酸的分离实验 ,结果表明 ,在体积流量 1mL/min,pH=6.47.4,原液质量浓度 10 mg/mL 条件下 ,AB-8 树脂对甘草酸的吸附量最大 ,可达 120 mg/mL,洗脱比较容易 ,分离效果
16、好 ,纯度可达 95%以上。 2.3.4 超滤膜分离法 (ultrafiltration membraneseparation,UMS) 膜分离技术是发展较快的分离技术，其原理是以压力为推动力实现溶质与溶剂的分离 ,在常温下粗提液经过超滤膜 ,可将还原糖、蛋白、淀粉等大分子物质除去 ,然后对超滤液中的甘草酸进行沉淀或吸附纯化。该方法操作简单 ,无相变、能耗低 ,不需消耗过多的各种试剂和溶剂 ,提高了甘草酸的提取率。 2.3.5 聚酰胺法 18 潘福生等把甘草提取所得甘草酸粗品制成的单铵盐吸附在粉状聚酰胺上 ,先洗脱甘草酸单铵盐以外的杂质 ,再用极性溶剂洗脱甘草酸单铵盐 ,浓缩 ,再通过强酸型阳
17、离子交换树脂脱胺 ,从而制得甘草酸 (纯度可达 99.5%100%)。 2.4 甘草酸含量测定 2.4.1 传统测定方法 传统测定甘草酸含量的方法是根据甘草酸遇酸沉淀或酸碱反应的理化性质采取重量法或滴定法测定 ,或根据其颜色反应采取比色的方法测定 ,以及根据其紫外吸收特性采用紫外分光光度法测定。重量法是将甘草酸提取液进行过滤 ,加入浓盐酸或硫酸 ,使甘草酸沉淀析出 ,过滤烘干后精密称量 ,即得到样品中含有的甘草酸质量。 2.4.2 薄层扫描法 (TLC) 该方法原理与比色法或分光光度法有类似之处 ,通过测定薄层扫描仪的单色光透过薄层板上的组分斑点的透光度或反光度 ,来 定量测定样品中组分的含量
18、。由于采用了薄层色谱与微型计算机扫描相结合的技术 ,因此可同时对大量的样品进行测定 ,操作简单、快速 ,灵敏度好 ,精密度较高。 2.4.3 气相色谱法 (GC) 一般甘草酸先水解为甘草次酸并酯化后测定。取一定量溶液注入二甲基氯硅烷化(DMCS)的玻璃柱内 ,在 290操作 ,氮气为载体 ,体积流量 6080 mL/min,火焰离子化检测 ,由标准曲线得出甘草酸含量。 2.4.4 高效液相色谱法 (HPLC) 与 TLC 和 GC 相比 ,HPLC 具有重复性好、受环境和操作影响小、操作简单、测定迅速的特点 ,成为近 年来中药有效成分分析的重要方法 ,在甘草研究中已获得广泛应用。流动相通常为甲
19、醇 -水 -醋酸或水 -乙腈 -醋酸等 ,紫外检测波长为 254 nm,色谱柱为 ODS C18,体积流量1.0 mL/min,柱温 30。 2.4.5 毛细管电泳法 (CE) CE 的原理是以高压电场为驱动力 ,以毛细管为分离通道 ,根据样品中各组分之间电淌度或分配行为差异而实现分离的液相分离方法。其特点是样品用量小、柱效高、速度快、自动化程度高 ,可简化样品前处理并有利于多组分分析 ,目前已成为药用植物有效成分分析的主要高效定量分析技术之一 ,在甘草酸的测定 中发展也较快。 2.5 甘草酸单钾盐的制备 2.5.1 甘草酸三钾盐的制备 甘草酸粗品粉碎、过筛 (60 目 )，然后装入迥流提取器
20、中，用 5 倍干粉体积的丙酮迥流提取 2 次，每次 lh，合并迥流提取液进行浓缩，浓缩至原体积的 1/2 时，滴加 20%KOH 的乙醇溶液调至 pH8 一 8.5，使甘草酸三钾沉淀，其沉淀体系经离心机分离后，把沉淀中的溶剂挥发干净，得甘草酸三钾粗品。 2.5.2 甘草酸单钾盐的制备 取甘草酸三钾粗品用 5 倍体积冰乙酸在 60C 条件下热溶解，然后自然放置冷却，待析出甘草酸单钾后，抽滤分取结晶，得甘草酸单钾。 2.5.1 甘草酸单钾盐的纯化 取甘草酸单钾用酸性乙酸乙酷溶解，过滤 (乙酸乙酷不溶物主要是甘草次酸 )，滤液用10%KOH 的乙醇溶液调至 pH8，使甘草酸单钾重结晶，待结晶析出后抽
21、滤分取，然后用少量乙酸乙酷洗涤，干燥，即得高纯度甘草酸单钾盐。 3 结论 近些年来，随着分子生物学的高度发展和日臻完善，使得甘草的研究也从宏观逐渐走向微观，宏观和微观共同发展，互相渗透。既涉及古籍复方的应用，又涉及基因水平的探讨。目前，有关甘草及其复方的药理作用的研究开展得较为广泛，但甘草的临床应用多数以古代文献记载为依据，甘草化学成 分的微观鉴定及其临床作用机制和效果评定有待进一步研究。随着中医中药学的迅速发展与现代技术研究手段的结合，甘草有效分离成分的鉴定会更加细微，其药理作用会更加明确，甘草及其制剂也会广泛有效地应用于临床。在不久的将来，甘草有可能作为高效低毒的天然药物，在治疗癌症和艾滋
22、病方面发挥其作用，而甘草的多靶点药理作用也为其临床的广泛应用奠定了坚实的基础。 4 文献综述 1 范云鸽 ,史作清 ,何炳林 .甘草酸、甘草次酸的提取分离及应用概况 J.天然产物研究开发 ,1996,8(4):93-99. 2 胡志厚 .甘草酸 类药物的研制及应用 J.药学学报 ,1998,23(7):533-460. 3 李 晓 学 , 温 文 秀 . 甘 草 酸 及 其 衍 生 物 的 制 备 和 应 用 J. 中 国 医 药 工 业 杂志 ,1993,24(10):475-478. 4 李平 ,陈东鸿 ,程建峰 ,等 .地塞米松及甘草酸对小鼠肝细胞凋亡的影响 J.中国药理学通报 ,199
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