1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 淀粉酶的研究进展 1. 淀粉酶简介 淀粉酶是催化淀粉、糖原转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，广泛应用于淀粉工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒等行业 1。淀粉酶是最早用于工业化生产的酶，迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一 2。 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。常见的淀粉酶可以分为以下几种： -淀粉酶（ EC3.2.l.1），也叫液化酶； -淀粉酶（ EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（ EC3， 2.1.3）， 也叫 -淀粉酶，简称糖化酶（缩写 GA 或 G）：异淀粉酶（ EC3.2.1.68）
2、等 3。 -淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为 构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降； -淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为 构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解 -l， 4 糖苷键和分支的 -1， 6-糖苷键，生成葡萄糖。异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的 -1， 6 糖苷键，切下侧枝链 5。 对淀粉酶 的分类和作用机制研究较多，可按来源、产物的旋光度、作用机制等进行分类。但近年随着酶学性质的研究的发展，对酶的作用机制、方式等研究不断取得新成果，分类学问题出现
3、许多难点。我国在食品方面研究和应用的微生物酶估计有 30 多种 6，其中淀粉酶有 -淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、环糊精生成酶等。 2. 淀粉酶的生产 2.1 淀粉酶的来源 淀粉酶的来源很广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的两种淀粉酶为 -淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于 植物中的 -淀粉酶也存在于少量微生物中。 -淀粉酶可以从几种细菌、真菌和酵母中分离获得。但是，由于细菌淀粉酶具有几个比较优良的特性，因此，细菌淀粉酶用的比较多，特别是淀粉液化芽孢杆菌已用于工业化生产 5。 不像其他的淀粉酶，微生物仅产生少量的 -淀粉酶
4、，有杆菌（假单孢杆菌和梭状芽孢杆菌）等。 2 葡糖淀粉酶具有多种来源，植物、动物及微生物，但是，商业上所用的葡糖淀粉酶也是来源于微生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要来源。 2.2 淀粉酶的生产 淀粉酶的生产主要有两种方法，即液态 发酵和固态发酵。由于固态发酵具有经济上和工程上的优点，因此人们常常采用这种方法生产淀粉酶。 2.2.1 -淀粉酶的生产 杆菌是 -淀粉酶的最重要的来源而且可以用于酶的生产。解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以生产耐热的 -淀粉酶，同时也可以进行生产酶及淀粉的水解 5。 在乳清、玉米浆以及大豆粉的基础上，开发了一些简单而又便宜的培养基用于 -淀粉酶的生产，这种培养
5、基也可以进一步开发成为工业生产 -淀粉酶用的培养基。一些研究表明，不同的碳源会影响 -淀粉酶的产量，乳糖、葡聚糖及可溶性淀粉有利于酶的产量的 提高，当使用葡萄糖时，酶的产量非常高。溶氧率也是 -淀粉酶发酵生产时的一个重要的因素，高的溶氧率可以产生大量的酶。 丝状真菌是胞外酶的最大的生产者，因此，用这些菌来生产 -淀粉酶也引起人们的兴趣，嗜热真菌是 -淀粉酶最好的生产菌，调节其生长条件和培养基成分，可以使酶的产量增加。 固定化细胞培养技术也用于 -淀粉酶的生产，用这种技术可以极大地提高酶的产量，如将地衣芽孢杆菌固定在膜上，生产的 -淀粉酶比游离细胞产量多 176%。 2.2.2 -淀粉酶的生产
6、如前所述， -淀粉酶主要来源于植物，因此用微生物生产 -淀粉酶的工作不多。可以产生 -淀粉酶的微生物有多黏芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、假单胞菌等。 人们用来自于木薯、玉米、土豆、小麦和小麦麸等的废弃淀粉作为底物来生产 -淀粉酶，发现以木萝和小麦麸为底物的 -淀粉酶产量最高；还有人用固定化细胞的方法来生产 -淀粉酶，在所有的方法中，离子化的凝胶作用于 -淀粉酶的生产最有效。 2.2.3 葡糖淀粉酶的生产 用黑曲霉以固状培养的方式生产葡糖淀粉酶已作了大量的工作，这些研究包括农副业与工业的废弃物如小麦麸、米糠等对黑曲霉生长和活性的影响，此外，这些物质及 湿度还明显地影响酶的生产。一些细菌和
7、酵母也可以生产葡糖淀粉酶。 发酵罐的设计和结构也影响酶的生产，如栽培木箱 36 小时所产生的酶的量相当于摇瓶培养 96小时所产生的酶的量。此外，培养方法不同酶的产量也不一样，如分批培养比一次投料的效果更好。 2.3 淀粉酶的纯化和性质 运用于医药和治疗的淀粉酶需要更高的纯度，因此，开发出一种经济有效的方法对酶进行纯化3 从而获得具有活性的化学纯的酶是非常重要的。传统上，对发酵罐中的淀粉酶的纯化分为几个步骤：培养物的离心、用超滤法获得选择一定浓度的上清液、用硫酸铵或有机溶剂如冷乙醇 获得沉淀中的酶、粗制的酶用色谱法和胶过滤纯化。 细菌的 -淀粉酶可以从杆菌中获得，人们已经研究了喜温菌株和耐热菌株
8、的纯化和特性。一些研究者用硫酸铵沉淀、离子交换色谱和胶过滤法纯化获得了同质的 -淀粉酶，焦碳酸二乙酯可以抑制此酶的活性。由地衣芽孢杆菌生产的细胞外耐热型 -淀粉酶可以用下面的方法纯化：在乙二醇葡聚糖系统中做两层分离，然后用胶过滤和离子交换色谱进行纯化 7,8,9。 细胞外淀粉酶的基本性质反映了细菌所生长环境的酸碱度和温度，如某些碱性杆菌生长于 50 ，pH 为 10.5，其产生的 -淀粉酶的最适温 度和 pH 分别为 60 和 pH 值 11.0 12.0；另一类杆菌生长的最适 pH 为 8.5，所产的 -淀粉酶最适 pH 为 9.0。 在工业化的生产中，人们常常用自动聚焦的纯化技术获得化学纯
9、的淀粉酶，这种方法可以纯化一些枯草芽孢杆菌产生的 -淀粉酶。此法可以采用大量的起始反应物，可以大量生产 -淀粉酶。 在真菌中，获得纯化的 -淀粉酶仅有很少的一些菌株，因此它们的性质研究也不多。不同的菌株所产的 -淀粉酶性质不一样 10。 酵母的 -淀粉酶获得纯化的酵母 -淀粉酶也不多，从隐球酵母生产的可以消化生淀粉的耐热 -淀粉酶的纯 化仅用一步方法便可以解决，这种酶与黑曲霉和米曲霉产生的 -淀粉酶性质相似 11。 从微生物中获得的 -淀粉酶比从植物中获得的 -淀粉酶具有更高的耐热性， -淀粉酶与 -淀粉酶相比，其最适的 pH 更高，而且不需要 Ca2 作为酶的稳定剂和提高酶的活性，用硫酸分级
10、分离，离子交换色谱和胶过滤的方法纯化。 Hg2 、 Zn2 和 Cu2 可以抑制酶的活性， Na 可以激活酶。加入支链淀粉酶可以极大地提高酶对生淀粉的降解。此外，麦芽糖是 -淀粉酶运用于生谷物淀粉的水解产物。 许多菌株产生的葡糖淀粉酶已获得纯化，性质也获得了确定 。总的来说，葡糖淀粉酶的最适 pH为 4.5 5.0，最适温度为 40 60 ，但也有一些例外，有些酶的最适 pH 值可达 11.0。 商业上从黑曲霉中获得的葡糖淀粉酶制备物中包含有六种类型，其分子大小明显不同，最适的pH 值在 3.5 5.0 之间。通过纯化根霉产生的葡糖淀粉酶，可以获得两种葡糖淀粉酶，一种酶具有强的脱支链的活性，另
11、一种酶脱支链的能力较强。此外，还有对生淀粉的吸收和消化能力都特别强。 3. 淀粉酶的研究进展 淀粉酶中，尤以 -淀粉酶最为常用，随着社会需求的增大，工业生产对 -淀粉酶的需求量越来越大。 4 3.1 -淀粉酶的催化机理 目前公认的 -淀粉酶的催化机理 12,13，催化中心位于 /桶状结构的底部， 261 位谷氨酸和 231位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体 261 谷氨酸质子化；第二步，亲核基团 231 位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的 C1，糖苷键断裂，葡萄糖残基与 231 位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的 261 位谷氨酸夺取
12、一个水分子H+，产生一个 OH-；第三步， OH- 攻击葡萄糖残基的 C1，使酯键断裂， 261 位谷氨酸和 231 位天冬氨酸重新恢复初 始状态。在已知结构的 -淀粉酶中，在 /桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相对位置相似，并且所有 -淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的 13。以对 -淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋势。 3.2 -淀粉酶的突变研究 目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。随
13、机突变首先需构建突变文库，然后根据研究 酶的特点设计高通量的筛选方法。它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。将这些方法应用于 -淀粉酶的研究已有一定进展。目前有关突变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如 Takase 研究发现天冬酰胺 326 赖氨酸 /天冬氨酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌的 pH 特性 14。 Nielsen J E 等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺 264 丝氨酸和天冬酰胺 190 苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性。 Shaw A 等 15通过随机突变，得到
14、 Met15Thr， 能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现 Met15Thr 和天冬酰胺 188 丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高 2 倍 16。但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变有待进一步研究。 3.3基因克隆及氨基酸序列 分子生物技术的发展，对 -淀粉酶的研究已进入分子水平阶段，在 -淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的 -淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。 Suganum a 等 研究了 -淀粉酶的
15、 N-端氨基酸序列。 Kim 等 描述了编码一种新 -淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达 17。 5 Steyn 和 Pretorius 编码 -淀粉酶基因 (AMY)编码 GA 的基因 (STA 2)转入一个酵母菌的整合载体(Yip5)，形成重组质粒 pSP1 和 pSP2， AMY 和 STA 2 被一同连接到载体 Yip5 中，产生质粒 pSP3。随后，编码抗 Geneticin 418 显性标记的 A PH 1 被克隆到 pSP3 中得到 pSP4。为了增强 Geneticin 418的表达， pSP4 再连接启动子 GAL10 和终止子 URA3，这样就得到质粒 pSP5。
16、 pSP5 通过增加 ARS1H和 CEN4 序列被修改成环形微染色体 pSP6。转入了 pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种-淀粉酶和 GA 18。 4. 结论 淀粉酶是工业中最重要的酶 ,淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶，特别是 -淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀 粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。应用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用 -淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也应
17、该开发具有有效 -淀粉酶活性的菌株， -淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。 参考文献 1 孙晓菲 ,李爱江 .-淀粉酶的应用及研究现状 .J.畜牧兽医科技信息 ,2008(6):13-14. 2 张双民 .土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化 .J.土壤肥料 , 2006(2):59-60. 3 喻凤香 ,林亲录 .甜酒酒曲根霉淀粉酶研究进展 .J.中国食物与营养 ,2005(4):26-28. 4 颜守保 .产耐酸性 -淀粉酶菌株的筛选、
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