1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 高产灵菌红素菌株培养条件优化 摘要 ： 灵菌红素是（ prodigiosins， PG）一类研究较多的天然红色素，含甲氧基吡咯骨架结构。是一些放线菌、沙雷氏菌及其他细菌的次级代谢产物，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。由于灵菌红素的各种生理活性，因而成为研究的热点。现对灵菌红素的结构、生物活性、生产现状及发展趋势作一综述。 关键字 ： 灵菌红素 抗肿瘤 抑菌 前言 在人类生活中所使用的色素，一般分为合成色素和天然色素两大类 。随着各种分析技术和病理学的发展，合成 色素的安全性得到了质疑。现今，人们抵制使用合成色素的情绪日益激烈，合成色素在各
2、国所允许的使用限度大大降低，尤其在食品、医药和化妆品行业 1。因此，开发天然色素是世界应用色素发展的趋势，天然色素具有安全可靠性，营养，没有毒副作用，色调自然，纯天然等优点，同时还有一定的药理作用。随着行业的发展，色素的应用也随之不断扩大，对天然色素的需求不断的提高。而灵菌红素就是最热的天然色素之一。 灵菌红素是一类天然色素的总称，它是一类混合物，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，这个结构是由 Amak 等研究 Serrati 生长时发现的，包括 prodigiosin， prodigiosim25-C，metacycloprodigiosi(nMP)desmethoxyprod
3、igiosin 和 uncedylprodigiosin(UP)等，是由一些放线菌、沙雷氏菌及其他细菌产生的次级代谢产物 2-3，具有多种生物活性，如抗肿瘤活性，免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等。 目前，灵菌红素主要是通过微生物发酵法获得，能产生灵菌红素的微生物主要有链霉菌属（ Streptomyces）、沙雷氏菌属（ Serratia）和假单胞菌（ pseudomonas）等种属 4，而其中以沙雷氏菌属（ Serratia）微生物合成灵菌红素的报道最多。 1、灵菌红素的物理、化学性质 PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂
4、如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG 对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； Al3+， Ca2+， K+ ， Ba2+ 等金属离子对 PG 2 的稳定性影响不大， Zn2+ 有使 PG 增色的作用， Mg2+ 和 Mn2+ 对 PG 有一定的破坏作用， Pb2+ 可以络合 PG，使之成为沉淀 5；白光和蓝光使 PG 发生光解，在红光和远红光下 PG 则不会降解 6。 2、灵菌红素的生物活性 2.1 抗肿瘤活性 Montaner 等 7的研究表明，灵菌红素能诱导人结肠腺癌细胞株 DLD-1 和 SW-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 凋亡，对转移
5、性肿瘤细胞株 SW-620 更为有效，其诱导结肠癌细胞凋亡呈剂量依赖性，主要表现为细胞收缩、染色质缩合、肌动蛋白微丝结构重组等。目前对 PG 的抗肿瘤作用机制尚不十分清楚，对 PG 诱导细胞凋亡机制的研究主要集中于与细胞存 活相关的信号转导， Montaner 等认为，PG 色素通过诱导 p38-MAP 激酶（ p38-MAPK）的磷酸化而促使细胞凋亡。 Songia8 等则认为，灵菌红素通过抑制视网膜母细胞瘤易感基因（ retinblastoma， Rb）的磷酸化作用与抑制细胞周期蛋白酶 2 和 4（ Cdk-2， Cdk-4）阻滞人淋巴细胞的增殖。 Yamamoto 等 9将灵菌红素的抗肿
6、瘤作用归因于能促使 H+和 Cl-的同向跨膜转移，引起空泡型H+-ATP 酶（ V-ATPase）解离，使胞液酸化引起凋亡。 Castillo-Avila 等研究了 灵菌红素对结肠癌细胞溶酶体内 pH 值及细胞繁殖周期的影响，结果表明，灵菌红素 促使溶酶体内 pH 升高，结肠癌细胞株 HT29 的繁殖被阻滞在 G1 期，支持了 Yamamoto 等胞液酸化从而引起凋亡的观点。但此观点备受争论，其焦点是胞液酸化在细胞凋亡中能起到多大作用。 Melvin 等 10认为，灵菌红素对肿瘤细胞的杀灭作用与其核酸酶特性相关。由于灵菌红素富含电子而被氧化并还原 Cu 2+，引发铜离子诱导的双链 DNA 裂解
7、，表现出细胞毒活性。并用显微荧光技术研究了灵菌红素对 DNA 的结合作用，用琼脂糖凝胶电泳研 究了灵菌红素对铜离子诱导的 DNA 裂解的作用。 Subramanian 等 11从微球菌（ Micrococcus sp.）分离出灵菌红素结构类似物具有核酸酶特性及抗肿瘤活性，实验表明，此化合物能有效地与 DNA 结合，并促进铜离子介导的 DNA 裂解及膜脂质过氧化，对鼠源淋巴瘤细胞株 EL4 和人源慢性骨髓瘤细胞株 K562 有显著的细胞毒活性，抑制瘤细胞的增殖。 Zhang 等 12研究了灵菌红素对胰腺恶性肿瘤细胞株 8898 的抑制作用，研究表明，灵菌红素在较低的浓度下即可对 8898 胰腺癌
8、细胞的增殖产生明显抑 制，而且，与非肿瘤细胞的 Swiss-3T3 细胞的平行实验表明灵菌红素对肿瘤细胞具有一定的特异性抗细胞增殖的作用，而非肿瘤细胞对于灵菌红素的作用敏感性较低。 以上研究表明，灵菌红素具有抗肿瘤性性能，能在医学上有巨大的应用潜力。 3 2.2 抑菌活性 灵菌红素具有抗细菌、抗真菌的生物活性。 Cang 等 13以沙雷氏菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀灭租用。其结构类似物具有显著的抗 Tri-chophyton spp.等真菌的活性，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis 引起的 一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用14。 2.3 免
9、疫抑制性活性 选择性免疫抑制包括在自体免疫性疾病治疗和临床器官移植中能抑制信号传递，预防 T 细胞激活。研究表明， PG 色素抑制磷酸化并激活细胞质酪氨酸激酶 JAK-3，与细胞表面受体 common -chain 结合，阻断 common -chain 的信号转换功能从而表现出特效的免疫抑制活性 15。因而， PG是一种潜在的新型免疫抑制药物。 PG 能显著抑制由多克隆丝裂原 PHA 和 PWM 刺激的人源 T 淋巴细胞及 B 淋巴细胞的增殖，还能促使 Con A（伴刀豆球蛋白 ）刺激的脾细胞凋亡，但对脂多糖刺激的脾细胞增殖无抑制作用（只有浓度较高时对脂多糖刺激的鼠源 B 淋巴细胞有抑制作用
10、）。表明此化合物能选择性地抑制 T 淋巴细胞增殖，同时可诱导人源 T 淋巴细胞株 Jurkat cells 发生凋亡，以及抑制氢离子迁移。因此， PG 是一种潜在的新型免疫抑制药物。 2.4 抗疟疾活性 Isaka等 16从 Streptomyces spectabilis BCC 4785的发酵产物中分离得到的 MP 有显著的抗疟疾活性。体外实验表明，其抑制 Plasmodium falciparum K1 的 IC50 为 0.005 0 0.001 0 g/mL。 此外，灵菌红素能保护海洋细菌免遭太阳辐射损害或原生动物侵蚀，具有抗 Dinoflagellates 的活性 17，灵菌红素对
11、引起查格斯疾病的锥虫（一种寄生虫）有很大的杀伤作用，其杀锥虫活性（ IC50=5 mol）是经典杀锥虫药 Nifurtimox 活性（ IC50=150 mol）的 30 倍。灵菌红素可作为生物农药用于防治 Botrytis cinerea 等引起的樱草属植物病害。对其抗菌、抗疟疾和抗原生动物等的作用机制有待进一步研究。 灵菌红素具有强烈的细胞溶解酶 活性，能杀灭引起赤潮的浮游藻类 18，将其撒在赤潮中， 1/10的浓度 1h 就能杀灭导致赤潮的大部分浮游生物。 3、灵菌红素的生产现状 20 世纪 60 年代早期， Rapoport 等首先描述了 PG 化学合成的全过程，但是比较复杂和困难。
12、1996年 D Alessio 19等提出了新的制备 PG 类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和 A 环结合（以往模拟生物合成路线是先将 B 环和 A 环相连）即得 PG 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能用来合成天然的十二烷基 PG。 4 利用化学合成法不能合成纯天然的 PG，因此，人们寄希望于 微生物发酵生产。并且，研究多为使用沙雷氏菌发酵生产灵菌红素。 王学东 20对野生黏质沙雷菌株进行紫外诱变处理，筛选获得的链霉素抗性菌株摇瓶产量达到120 mg/L，发酵产量可达 160 mg/L。 Tao 等 21紫外诱变获得了一株沙雷菌株 B6，以葡萄糖为初始碳源，流加甘油为
13、 灵菌红素合成诱导物，所开发的流加发酵工艺不仅可防止菌体过早自溶，而且可部分消除 灵菌红素 产物的抑制作用，将 灵菌红素 的合成能力提高了 7.8 倍，达 583mg/L。 Wei 等 22-23以改进 LB 培养基，提高胰蛋白胨和酵母膏的浓 度并去除了 NaCl 发酵沙雷氏菌生产灵菌红素，约比 LB 增产了 3 倍，达 152mg/L；在培养基中添加 2% 6% 的植物油，如豆油、棕榈油、葵花子油等可促进灵菌红素的合成，最高达 790 mg/L，表明灵菌红素合成与胞外生物表面活性剂的存在有关。在 YE 培养基中添加含吡咯环的脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸可显著促进 UP 的合成。当添加 10g/L
14、 的脯氨酸时，产量可达 2.5g/L。 Cang 等从土壤中分离获得一株沙雷菌 S389，以乙醇为唯一碳源，灵菌红素 产量最高可达 2.95g/L。 Giri 等 24在黏质沙雷菌 的培养基中分别添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，均能显著增加灵菌红素产量，其中以添加花生籽粉最为显著，达到 38.75g/L。 Helvia 等 25在沙雷氏菌的培养基中分别添加木薯废水和甘露醇，能显著增加灵菌红素的产量，并大大的降低了生产的成本，并且灵菌红素的产量达到 49.5 g/L。 4、灵菌红素的应用前景 4.1 在食品上的应用 色素可以作为一种食品添加剂，人类最初使用的都是天然色素，但是随着合成色素发明之后，
15、逐渐取代了天然色素。但是，随着人们生活水平的提高，人们对饮食安全越来越注重，发现合成色素使用过量有 致癌的危险，对人体有巨大的危害。而天然色素作为食品添加剂，具有安全性，无毒，色泽鲜艳，还具有一定的营养和药理保健作用，有完全取代合成色素的潜力。 4.2 在纺织染色上的应用 研究表明，使用灵菌红素来染色，其结果比其他染料的颜色更易上色，更鲜艳，耐洗等优点，还有，灵菌红素本身具有抑菌性等性能，对被染色的纺织物有杀菌的作用，对人体更安全。而且，灵菌红素在纺织染色上使用的纯度要求并不高，对色素的分离提取要求较低。但是，灵菌红素对光具有光敏性，在光下，易分解 26。总之，灵菌红素在纺织上的应用前景较大。
16、 4.3 在环境发明想应用 5 1996 年韩国科学家研究发现，灵菌红素可以很好的治理赤潮。将灵菌红素撒在赤潮中，只需十亿分之一的浓度，一小时后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。这一发现，在环境特别是水体赤潮污染有巨大的意义 27。 4.4 在医学临床上的应用 根据灵菌红素的生物活性，抗肿瘤性，免疫抑制性，抑菌性等，在医学上有着巨大的前景。但是灵菌红素在医学上的应用，需要很高的纯度，必须通过国家药用标准，这对灵菌红素的下游的分离提取有严格的要求。虽然灵菌红素的医学作用机理还不是很清楚，但大体上分为三个方面来作用细胞： 第一、灵菌红素能引发铜离子诱导的双链 DNA 的裂解与其分子中 A 环的结
17、构密切相关，完整的双吡咯环发色团结构灵菌红素显现铜介导的核酸酶活性的关键。 第二、灵菌红素可以破化细胞内的线粒体，高尔基体和溶酶体对细胞质的 pH 梯度，降低细胞内 ATP 水平。这是由于灵菌红素可以在这些细胞器的膜上起到离子孔（ Ionophore）的作用，而抵消氢氯离子的同向转运。 第三、灵菌红素可以激活细胞内细胞凋亡途径。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8（ Pro-Caspase 8），继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面， 它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ Apoptosis inducing factor，简称 AIF）而触发非半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。除此
18、之外，灵菌红素还会通过一系列诱导或抑制的作用达到抑制细胞周期的目的。另外，根据 Zhang等研究中，灵菌红素还可以促进细胞集结，阻止癌细胞对周遭组织的入侵或是远端转移。 总结 综合上述，灵菌红素在抗肿瘤，抗菌等方面有高的疗效，并在多个领域有广泛应用的空间，在未来会带来高的经济价值。但是，现在广泛的应用灵菌红素还存在很多的问题。首先，发酵生产灵菌红素的菌株不稳定， 在进行多次传代之后要进行复壮，否则其生产能力会大大的降低。其次，在进行菌株诱变时，其正向诱变的机会比较小，有较强的随机性，重复性差。第三，现在培养灵菌红素所使用的原料，均属于高价值的原料，生产成本高。第四，灵菌红素是一种水溶性差的物质
19、，易溶于有机溶剂，不溶于水，但是，在发酵过程中，由于菌的代谢和原料本身的属性，灵菌红素也会溶于发酵液中，分离提取困难。同时，由于是次级代谢产物，灵菌红素并不是一种纯的物质，而是一种混合物，很难分离得到有效的成分。以上种种问题，都是限制灵菌红素工业化生产的关键之处。因此，解决这些 问题将是科研工作者面临的挑战。同时，我们应该相信在不久的以后，灵菌红素必定能造福人类，改善人们的生活。 6 参考文献 ： 1 张梁 , 郝名慧 , 楼志华 , 石贵阳 . 一株产红色素菌株及对其红色素结构的鉴定 M. 生物加工过程 . 2008, 6(2): 2832 . 2Shieh W Y, Chen Y W, C
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