1、1 毕业论文 文献综述 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化进展 1 前言 淀粉酶 ( amylase， EC 3. 2. 1. 1)以淀粉或糖原为底物 ,是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它能从分子内部水解 - 1, 4- 糖苷键 , 广泛存在于动物、植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约 25的比例，应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织、石油开采等行业。由于该酶是一种有内切活性的淀粉酶 , 可在中性 pH 条件下将淀粉水解为糊精、寡糖、麦芽糖和葡萄糖等 , 从而使黏 稠的淀粉糊很快失去黏性而液化 , 碘的呈色反应很快消失 , 故又称为
2、淀粉液化酶 1， 2。此外它也可作为促消化剂运用于食品 3、医药工业淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要。 2 淀粉酶生产菌株的筛选 2.1 初筛 将在土壤中收集得到的菌株划线接种在淀粉培养基平皿上培养 2 4 d，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈产生证明为产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小初步确定酶活性的高低。 4 但应保存所有产淀粉酶的 菌株以用来复筛，因为同一菌株在不同的培养基以及不同的培养条件下产酶的情况可能不同。在平皿上生长和在发酵液中培养也可能会有很大的差别。 2.1 复筛 在淀粉酶生产
3、菌株筛选的过程中，最关键的是其产物，也就是淀粉酶的酶活的检测。由于测定原理和底物性质的不同，淀粉酶的测定方法已经超过 200种以上。 5这些方法可以归纳为两类：天然淀粉底物方法和（分子组成）确定的底物方法。以天然淀粉底物为底物的测定方法，如淀粉分解法、糖化法和色素淀粉法等。由于天然淀粉分子结构的不确定，故不同植物来源的淀粉和不同批号的淀粉，其分子 结构和化学性质不尽相同，因此难以达到方法学标准化，测定误差较大。 6目前除碘淀粉法和 DNS外，这类方法已被淘汰。使用（分子组成）确定的淀粉酶底物和辅助酶与指示酶组成的淀粉酶测定系统，可以改进酶反应的化学计2 量关系，能更好地控制和保持酶水解条件的一
4、致性。这些底物有小分子寡聚糖（含 3-7个葡萄糖单位）和对硝基苯酚糖苷等。其中，麦芽戊糖和麦芽四糖是极好的淀粉酶底物，试剂稳定，水解产物确定，化学计量关系明确。目前市售试剂盒就有好几种。但是就价钱来讲，较为昂贵。 2.2.1 DNS法测定酶活 7 利用 3， 5-二硝基水杨酸 (DNS)比色法测定还原糖含量来反映淀粉酶活力是目前较常采用的方法。一般的实验过程是：在 1%淀粉溶液中加入一定量的酶液， 37水浴 5min，加 DNS沸浴 5min，在 470nm比色，用麦芽糖同步作标准曲线，用单位时间内转化麦芽糖的量表示酶活性：麦芽糖 mg 5min-1 g-1。 该方法测试所用试剂易得，溶液有效
5、期长，同一批次测试精确度高。但相关文献在工作波长、培养 pH值、培养时间和显色时间等测试条件上差异较大 8-10，这些差异会直接影响同种测试方法所得酶活力之间的可比性。而且在灭活剂的选择 上，一般的有机灭活剂或者酸碱都会相应的影响到 DNS的显色反应。不同批次的 DNS也会造成测得的酶活的变化，实验可重复性差。 2.2.2 碘淀粉法测定酶活 11 碘淀粉法又称碘量法，该种方法的基本原理是淀粉 与碘反应，生成了一种包合物 (碘分子被包在了淀粉分子的螺旋结构中了），这种新的物质改变了吸收光的性能而变了色。而在淀粉酶存在的情况下，淀粉被分解，就可以根据吸光度变化测定出淀粉的水解情况，进而推算出酶活。
6、 12 一般的实验过程是：在在 1%淀粉溶液中加入一定量的酶液， 37水浴 15min，加碘应用液，在 660nm比色，用淀粉标准液同步做标准曲线。碘淀粉法的酶活表示为：在 37 ,15min水解淀粉 5mg为 1个单位。 但淀粉遇碘酒究竟显什么颜色，取决于该淀粉中直链淀粉与支链淀粉的比例，不同批次的淀粉可能比例不同，故该方法重复性不好，而且酶反应线性差，测定范围窄，高单位时往往误差较大。 尽管碘量法因底物难以标准化，反应不成零级反应等缺点而被认为不是理想方法，但因其简单、快速、灵敏和价廉而在国内应用较广。 2.2.3 试剂盒检测法 13 因为试剂盒检测法相比于前面两种方法较为昂贵，在生物实验
7、室或者大规模检测 时，一般很少使用试剂盒检测法。试剂盒检测一般用于临床检测血液或者尿液中淀粉酶的含量。该3 方法基本原理是利用 -淀粉酶水解 2-氯 -4-硝基苯酚麦芽三糖（ CNPG3）生成 2-氯 -对硝基苯酚，在 405nm 处吸光度的增加速率与样品中的 -淀粉酶的活力成正比。 3 培养基优化 3.1 常用的培养基优化设计方法 通常优化发酵培养基的方法是单次单因子法和正交试验设计法。采用单次单因子法时，只是讨论一种因素的影响，由于考察因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。 14正交试验设计则注重如何科学合理 地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平组合，但
8、它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。因此，人们期望找到一种，而响应面分析方法则是一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的回归分析方法，因此在培养基优化上应用最为广泛。 15 3.2 响应面分析方法的具体步骤 3.2.1 确定主要因素 确定要考察的过程中的关键因素，即研究范围内主要影响发酵过程和产品产量的重要因素。如果预先 不知道哪些是重要因素，可以通过极差试验或 Plackett- Burman 试验来确定这些因素。 3.2.2 确定中心试验点 响应面拟合方程只在考察
9、的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。所以，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。可以通过做单因素试验或由菌种的特性和发酵工艺来确定因素水平的范围。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向 , 根据各因素效应值的大小确定变化步长 ,能快速、经济地逼近最佳值区域 【 6】 。 3.2.3 确定试验点 采 用适当的试验设计，确定实验的试验点，试验设计强调试验点要尽量减少总的实验次数。试验点确定之后，按随机性原则对每个实验点进行实验，获得一定的数据，以便于进行统计分析。 3.2.4 数据分析 用适当的统计分析方法和计算机程序，对实
10、验数据进行分析，由分析得来的结果将用于下一步的过程优化，常用的统计分析软件有 SAS、 SPSS 等。 4 3.2.5 寻取最优值 为确定各因素的最佳取值，可以利用 SAS 软件进行岭脊分析 16，通过岭脊分析后，得出回归模型存在最大值点，以及相应的各种单因素的含量。最后再用 验证试验测定的淀粉 酶酶活与模型的最大值点进行比较，证实该模型是否具有有效性。 4 结论 从大量文献中可以看出，在菌株筛选时，一般用比较碘液水解圈直径与菌落直径比值（ D/d）的方法初步认定淀粉酶活。复筛时，较为常见的是 碘淀粉法和 DNS 法，通过测定复筛时各菌株的酶活来确定最佳的菌株。而在培养基优化方面，是在单次因子
11、法和Plackett-Burman 试验 的基础上，采用响应面分析，通过建立模型以及预计理论最大酶活值的方法，确定最终的优化方案。 5 参考文献 1 刘洋 ,沈微 ,石贵阳 .中温 - 淀粉酶的酶学性质研究 J.食品科学 ,2008,29( 9):373-377 2 李勃 ,党永 ,马瑜 .黑曲霉 Tx-78耐酸性 - 淀粉酶的分离纯化及其性质研究 J.微生物学杂志 ,2008,28( 4):30-34 3 吴雪辉 ,杨公明 ,李丽 .淀粉酶对方便米饭品质的改良 J.中国粮油学报 ,2009,24(lO):1-5 4Gangadharan D,Madllavm Nampoathiri K,Si
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