1、毕业论文 文献综述 生物工程 高效液相色谱测量发酵液中灵菌红素含量 摘要 ： 高效液相色谱法是具有分离分析效能高、速度快、检测灵敏度高等特点的分离技术 1。高效液相色谱 (high performance liquid chromatography HPIC)自 20世纪 70年代问世以来，经过近 30年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现在已成为化学学科中最有优势的分离分析方法之一。现对高效液相色谱的组成、技术、应用、前景作一综述。 关键词 高效液相 红色素 抗癌 抗菌 高效液相色谱的应用 范围十分广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。具估计，目前已知的化
2、合物中，有 80%的化合物需要用高效液相色谱法进行分离分析。此外，对无机物的分析也有很好的效果，特别是对生命活性物质的分离分析，有着其他分析方法不可替代的作用，已广泛应用于石油化工、生物化学、临床医学、食品卫生、环境监测、医药工业、商品检验、地质勘探、油田开发等领域的分离分析。 l HPLC技术简介 234 HPLC 法按分离原理可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法。由于 HPLC 技术的分析必须在 高效液相色谱仪中进行，所以该仪器对此技术非常重要。高效液相色谱仪主要包括进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，分述如下。 1 1 进样系统 一般高效
3、液相色谱仪采用隔膜注射进样器或高压进样阀完成进样操作。现代的许多新型仪器采用自动进样系统，取样、进样、洗针全部自动完成，减少了手工进样的误差，保证进样量的恒定，但自动进样的成本较手工进样要高很多 1 2 输液系统 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪 3 部分。高压泵是输液系统最重要的部件，常用的泵按输出液体情况分为恒压泵和恒流泵。现代的仪器装有压力检 测装置，以便在压力超过设定值时自动停泵，以防损坏仪器梯度仪是可进行梯度洗脱的装置，它和流动相贮液器一起使流动相可随色谱柱固定相和样品性质的改变而改变，使各种物质都能获得有效分离。 1 3 分离系统 该系统中最重要的为色谱柱，除此之外还包括连接
4、管和柱温箱。色谱柱一般长度为 1O50cm，内径为 4.6mm 或 3.9mm，通常由优质不锈钢材料制成，柱内装有直径为 5 10m粒度的固定相。高效液相色谱的柱温箱可使温度从室温调到 60 ，且保持恒定。 1 4 检测系统 HPLC 常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器、荧光检 测器和电化学检测器 4 种。每种检测器都有自身的特点和应用范围，可以根据被分离物质的不同选择合适的检测器。 1 5 数据处理系统 HPLC 的结果分析现在已经广泛使用计算机和色谱工作站来进行，该系统可完成数据的采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使分析结果的获取更加快速、准确，同时节约大量的时间。 2 高效液相色
5、谱的应用 2.1 HPLC 在医学中的应用 5 2.1.1 HPLC 测血药浓度 临床上应用的一些药物由于其有效血药浓度范围狭窄，个体差异大，且不同厂家产品存在生物利用度差异，其血药浓度与药效和毒性密切相关， 在治疗过程中需要常规监测其血药浓度。沈建幸等 6建立以高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英、卡马西平血药浓度的方法，方法为取患者血清经二氯甲烷提取后在 C18柱上分析，流动相为甲醇一水 (54： 43)，柱温为 30C ，检测波长为 254nm，流速为 0.8ml min。结果表明此方法简便稳定，用于苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度监测效果良好。此外测定一些药物的血药浓度可研究该药
6、在人体的药代动力学及药效学赵丽等 7用 HPLC法测定八血浆中的普鲁卡因，于仁娈等 8用 HPLC 法测定盐酸二甲双胍的血药浓度，结果 都表明该方法准确、简便、专属性强、灵敏度高，适用于临床药代动力学及药效学研究。 2.1.2 测定中药中的有效成分 由于中药药物成分复杂，所以需要建立有效、准确的方法测定中成药有效成分的含量，以控制产品质量。马开等 9用 HPLC 测定痛可停胶囊中欧前胡索和异欧前胡索含量，结果显示该法测定的欧前削素和异欧前胡索分别在 60325g 和 50250g 范围内与峰面积呈线性关系，平均回收率分别为98.3和 98.7， RSD 分别为 1.73和 1.65，表明该法可
7、作为痛可停胶囊的含量测定方法。曾海静等 10为了有效 控制复方葛根合剂质量，测定其有效成分葛根索含量，研究采用 HPLC 法测定其中葛根索含量，结果表明此方法操作简便，结果准确可靠，精密度好，可用于复方葛根合剂中葛根索的含量测定。 2.2 高效液相色谱在食品分析中的应用 11 2.2.1 蛋白质与氨基酸的分析 1213 蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链，相对分子质量大，在溶液中的扩散系数小，粘度大，易发生变性，这使他们的色谱分离情况不理想，因此蛋白质的分离和分析问题至今仍是具有挑战性的课题。 Mar Am.Yust14等用反 向高效液相色谱法检测饲料中的色氨酸。
8、其加权回收率为 98.6 100。与其他的分析色氨酸的方法相比，反向高效液相色谱法在检测时间上有所减少。李东等以 HyperilODS C18 色谱柱， 2， 4 一二硝基氟苯为衍生化试剂，梯度洗脱。结果表明所测氨基酸组分的浓度在0 2mg/L 0l3mg/L 范围内与峰面积之间具有良好的线性关系，回收率为 90.4 101.0，检出限为 0 12mg/L 1 225mg/L，测定结果的相对标准差为 1.05 5.93。陈春晓等采用高效液相色谱仪带全自动衍生功能的的自动进样器进行 在线衍生，经梯度分离，再利用二极管陈列 -荧光检测器串联分析。测定结果表明， 17 种氨基酸分离良好，线性范围为
9、10 mol/L 1000 mol/L，相关系数在0.9988 0.9999 之间，所测液体样品回收率为 90 97。 2.2.1 维生素的测定 维生素是人体内代谢过程中起重要作用的物质，维生素种类很多，化学结构上并无共性，它们可以分为胺类，醛类或醇类。 李克 15等采用离子对反向高效液相色谱法同时测定了复合维生素片中烟酰胺、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6等 4 种水溶性维生素的含量。以 Hy-persil C18化学键合硅胶为固定相，紫外检测器于 280nm 波长下检测。该方法已成功应用于复合维生素片中 4 种水溶性维生素的同时测定。 成志强 16等建立了以 0.05mol LKH
10、2PO4 一甲醇为流动相的梯度洗脱反向高效液相色谱同时测定维生素 C、 B1、 B2、 B6、 B12、烟酸、烟酰胺和叶酸的分析方法。方法检出限为 1.4 0.76ng，用该法测定了奶粉、玉米粉、饮料及复合维生素片中的水溶性维生素，相对标准偏差 2.8 8.8；加标回收率 74.7一 112.5。 2.3 高效液相色谱在环境监测中的应用 17 2.3.1 张梅凤 18应用高效液相色谱技术对生物样品农药残留进行了分析研究 色谱条件 :色谱柱 :416x25mmC18 柱，柱温 :30 ，流动相 :乙腈 :水 (35:65)，流速 210ml/min，检测器 :紫外检测器，灵敏度 0101 AUF
11、S，根据各组分设定合适的波长时间程序 .称取 510g 试样于 50ml离心管中，加入苯 10ml，无水硫酸钠 6g，匀浆 3min。将离心管放入离心机中以 2500 转 /min 离心5min。用吸管将上清液转入 20ml 离心管中。残渣再用 2 5ml 苯提取两次，合并提取液并于 50水浴上用氮气吹干。离心管 冷却至室温，用 5ml 乙酸乙醋将残渣洗入层析柱中，以 2ml/min 的流速使溶液流出并弃去。用 15ml 洗脱液洗脱组分。洗脱液于 50水浴上真空蒸干，用 110ml 流动相溶解残渣，取上清液进样。 2.3.2 崔莹 19应用高效液相色谱技术对环境中的磷脂进行了分析研究 用 si
12、lica 硅胶柱为固定相，也有用 CN 氰基柱、 NH2 氨基柱和 DIOL 二醉柱的报。流动相有氯仿一甲醇一氨水、正己烷一异丙醉一水以及乙睛一甲醇一水，在流动相中加入离子抑制剂如 85%磷酸、乙酸馁、 30%氨水、乙酸，可以有效改善峰形，抑制色谱峰拖尾磷脂在正相 色谱中的分离是由于各组分分子极性大小不同，流出顺序不同，各组分得到分离。如硅胶住上 .正己烷一异丙醉一水为流动相时， PE 极性最小， PC 极性最大， PI 位于中间，故一般的流出顺序为 :PE、 Pl、 PC，当甲醇一乙腑一磷酸为流动相洗脱时略有差别，流出顺序为 PI、 PE、 PC。 3 结语 20 目前高效液相色谱仪与结构仪
13、器的联用技术是一个重要的分析检测手段。液相色谱一质谱联用技术，使得液相色谱的高分析能力和质谱高鉴定能力相结合，对复杂样品体系，特别是生物医学领域的研究提供了更进一步的有效方法 ;HPLC-NMR 的分析方法已 经被证明为生物化学和药物化学分析中重要的分子结构鉴定方法之一 21。 高效液相色谱技术作为一种十分有效的分析分离手段，已经广泛应用于石油化工、生物化学、食品卫生、医药工业等领域一些色谱技术的相互结合解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确分析结果，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，随着技术的不断改进与发展，相信不久的将来，高效液相色谱必将在更多的领域发挥
14、重要作用。 参考文献 1赵铁男 . 高效液相色谱技术影响因素的选择 J.分析实验室。 2007(12):340-341 2于世林高效液相色谱方法及应用第 1版北京：化学工业出版社 2000.1 10 3徐葆筠，杨根元实用仪器分析第 l版北京：北京大学出版社 1993.207 209 4何艳红 . 高效液相色谱技术简介及其在医学研究中的应用 J. 中国现代实用医学志 .2007,1(1):27-29 5刘慧明 .高效液相色谱技术及其在药物分析中的应用 J. 中国现代医生 .2007(11):155-156 6沈建幸，陈均良高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度 J.中国药房
15、2004， 15(4)： 97 99 7赵丽 ,赵嘉训 ,牛悦峰等高效液相色谱法测定人血浆中的普鲁卡因 J中国医学检验志 2005,6(5):356 358 8于仁娈 ,魏振满 ,刘峰群等 RP-HPLC测定盐酸二甲双胍的血药浓度 J.懈放军药学学报 .2005.2l(4):300 302 9马开 ,秦文杰 HPLC测定痛可停胶囊中欧前胡素和异欧前胡素含量 J.中成药 .2005.25(10):80l一 803 10曾海静 .章小萍 .曹丽冰 HPLC测定复方葛根合荆中葛根素含量 J广东药学 .2005.l5(5):l0 12 11牛乐 .李建科 . 高效液相色谱技术 (HPLC)在食品营养及
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