1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 灵菌红素合成酶基因的克隆 摘要 ： 本文对灵菌红素的结构，生产该色素的相关菌种以及生理活性作了简要的概述，总结了灵菌红素近年来的研究进展，尤其是关于 PigC 基因方面的研究，对灵菌红素的发展前景进行了展望。 关键词 ： 灵菌红素 菌种 抑癌 抗菌 基因 引言： 灵菌红素 ( Prodigiosins)是可是一类含有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的化合物，由沙雷氏菌、放线菌及多种海洋细菌（包括 Hahella chejuensis KCTC2396 和假单胞菌）产生的一种天然色素 1 Microbiology,Dec2006:887-899.，其中以
2、 Serratia 属微生物生物合成灵菌红素的报道居多。由于具有抗细菌、 抗疟疾、抗真菌、 抗原生动物、 抗癌 2、 免疫抑制活性 3,4 和快速杀死导致赤潮的大部分浮游生物 5 等重要生物活性 ,因此它在医药、 食品添加剂、 环境治理、 纺织染料 6 和农业病虫害防治 7 等方面具有广阔的应用前景和巨大的研发价值。用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于微生物发酵生产。目前国内外对产 PG 微生物的研究主要集中在陆地微生物沙雷氏菌上。 现对灵菌红素的结构、生物活性、研究现状及发展趋势作一综述。 1. 灵菌红素的理化性质 灵菌红素 ( Prodigiosins)是一类含有 3 个
3、吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的化合物。灵菌红素(prodigiosins)又名灵菌素、灵杆菌素，分子式为 C20H2N305 (M=323.1968)，具有三吡咯环骨架结构，根据其侧链基链基团结构的不同，灵菌红素族还包括除 Prodigiosin 外的 Prodigiosin- 25-C，metacycloProdigiosin Prodigiosen Cycleprodigiosin， desmethoxyprodigiosin 和 Uncedylprodigiosin 等一系列结构和性质相似的物质。 灵菌红素是一种呈暗红色的色素，具有绿色反光，熔点 151.152 。在碱性或中性溶液中呈
4、橙黄色，酸性溶液中呈红色在甲醇溶液中，酸性条件下在 540 nm 处有特征吸收，碱性条件下在 466 nm 处有特征吸收， PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇，丙酮，氯仿和苯，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶， PG 对温度稳定，但受 pH 的影 响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； A13+， Ca2+， K+， Ba2+等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn2+有使 PG 增色的作用， Mg2+和2 Mn2+对 PG 有一定的破坏作用， Pb2+可以络合 PG，使之成为沉淀，白光和蓝光使 PG 发生光解，
5、在红光和远红光下 PG 则不会降解 8。 2. 生产灵菌红素的菌种 陈月琴 9 从大亚湾表面海水中分离到的 1株海洋产灵菌红素细菌，通过对该菌株 16S rRNA基因的测定与分析，并与 Genbank 的数据进行比较，认为该菌属于假单胞菌属。 刘军 10 对威海 近海海水和海泥中的产色素细菌进行筛选分离出 1株高产红色素的细菌 S15,利用 16S r DNA对 S15菌株基因组 DNA进行扩增 ,测序得到其部分 16S r DNA序列 ,经 Blast调出与菌株 16S rDNA同源的序列 ,用软件 MEGA (4.0) 按照 Neighbor - Joining方法构建 16S rDNA系
6、统发育树 ,判断该菌为沙雷氏菌属的一个种。提取色素后 ,对该红色素理化性质的试验发现 ,其光、 热等稳定性强 ,而 H2O2、 Ca2 +、 Fe3 +对其稳定性影响显著。 张琴 11 研究的是变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌 A3(2)的 rel A突变株，它们能合成微量放线紫红素和十一烷基灵菌红素。 Sertan-de Guzman12 从菲律宾的 被囊类动物中分离出一种新的 赝弧 杆 菌 Z143-1，它能酵解葡萄糖产生红色素（ 16甲基 -15庚基 -灵菌红素），该色素对金黄色葡萄球菌有抑菌作用。 D. Kim 13筛选出一株海洋菌株 Hahella chejuensis KCTC 2396
7、，它产生四种不同比例的灵菌红素，均具有生物活性。 3 灵菌红素的生物活性 3.1 抗肿瘤作用 PG具有有效的抗肿瘤活性，美国国立癌症研究所 (NSI)Melvin等发现 PG在平均 IC50为2.1molL-1时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌 、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞株中的 57种不同的人癌细胞均有抗性作用。 3.1.1 灵菌红素对人胰腺癌细胞增殖有抑制作用 14 有人通过用生物工程技术得到灵菌红素 , 通过 MTT 法研究了其对人胰腺癌细胞 8898 的增殖抑制作用和部分作用机理 , 实验结果显示 ,加入灵菌红素后的细胞表现出了凋亡细胞特异性，灵菌红素对于
8、恶性肿瘤细胞 ,在较低的浓度下 (24h 培养 , IC50值约为 20 25gml - 1) 即显示出了相当的杀伤效果，灵菌红素对肿瘤细胞形态学有一定的作用。实验提示其可能具有诱导肿瘤细胞凋亡的 作用。及具有靶向性抗肿瘤细胞增殖的作用。因此灵菌红素作为一种极具特色的抗癌新药 ,在这方面具有很大的潜力。 3.1.2 灵菌红素对白血病 ,癌细胞作用研究 15 3 有人对于海洋羽毛山海绵 Mycaleplumose的放线菌糖多孢菌 Saccharopolyspora sp (SP2 10)产生的十一烷基灵菌红素十一烷基灵菌红素 Metacycloprodigiosin（ MP）抗肿瘤活性及其作用机
9、制进行了研究。先采用 MTT法观察测定了 MP对小鼠白血病细胞株 P388、人肝癌细胞株 BEL 7402细胞生长的影响；采用流式 细胞术，检测了 MP对 P388、 BEL 细胞周期变化的影响；采用 Westem Blot法检测 PARP的裂解情况，判断 MP诱导两个细胞系凋亡活性。研究结果表明， MP能明显抑制 P388、 BEL 7402肿瘤细胞生长，将细胞阻断于 G2 M期并诱导凋亡； MP诱导活性氧是其导致细胞生长抑制的重要机制，并与其诱导的 P38、 JNK活化密切相关，而与 ERKl 2活化无关；并且初步发现 MP还能够抑制肿瘤转移的多个环节，可能对肿瘤转移具有抑制作用 3.1.
10、3 灵菌红素对乳腺癌细胞的作用 16 Ho, Tsing-Fen Peng, Yu-Ta等研究发现灵菌红素是一种强有力的抗癌活性细菌的代谢产物，这是由于它的凋亡作用选择性地在恶性细胞活跃。灵菌红素可剂量依赖性诱导下，可调节包括乳腺癌生存素在内的多种乳腺癌细胞系 MCF-7, T-47D 和 MDA-MB-231。 3.2 免疫抑制剂活性 17 链霉菌属和沙雷氏菌生产出红色物质包括灵菌红素 metacycloprodigiocin， prodigiosene，methoxyprodigiosin和灵菌红素 25 - C。具有抗疟疾的抗菌活性，尤其 是灵菌红素 25 - C显示了抑制免疫的作用。灵
11、菌红素对 T淋巴细胞的免疫反应有抑制效果，灵菌红素在其有效浓度范围没有显示毒性。因此，灵菌红素可以用来作为免疫抑制或在各个领域的标准物质，包括免疫疾病的治疗需要，器官或组织移植和免疫细胞为基础的疾病研究 3.3 灵菌红素抗菌作用 研究发现 MS-02-063 菌株能产生大量的灵菌红素类似物 PG-L-1，通过 NCCLS 法研究其体外抗真菌活性 18，研究结果表明，尽管其最小抑制浓度值比联苯苄唑微微要高，但却显示出了抗医学上分离的 9 种 Trichophyton 的菌株的能力 ，尽管 PG-L-1 导入角质层表皮的效率比联苯苄唑要低，但在低浓度下却显示出了更大的抗真菌潜力。 3.4 灵菌红素
12、 抗疟疾活性 Isaka等从 Streptomyces spectabilis BCC 4785的发酵产物中分离得到的 MP有显著的抗疟疾活性。 体外实验表明，其抑制 Plasmodium falciparum K1 的 IC50 为 0.00500.001 0g/mL19,20 此外灵菌红素的应用非常广泛，例如 Nobutaka Someya 等 21研究了植物附生微生物产灵菌红素在生物控制过程中 的作用的稳定性，实验分析了抗药灵菌红素的 16sRNA 与假单胞菌，根瘤菌等同属。实验结果显示，固有附生植物微生物可能可以通过削弱药物抗生素的能力从而妨碍植物病原体4 与生物控制药物的相互作用。
13、Tsukuba 等 22从沙雷氏菌中提取疾病抑制基因导入启动子控制的稻米细胞，发现这些基因修饰过的微生物能不受生物及非生物因素影响而有效抑制由 Pyricularia oryzae引起的稻米爆发性疾病 ；也可作为一种新型的饲料添加剂， 纺织工业中的染料，具有稳定性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等优点，目前正在开发应用当中 23。 4 灵菌红素生产现状和发展趋势 Wei 等 24， 25以改进的 LB 培养基（ MLB，提高胰蛋白胨和酵母膏的浓度并去除了 NaCl）发酵沙雷菌生产 PG，约比 LB 增产 3 倍，达 152 mg/L；在培养基中添加 2%6% 的植物油，如豆油、棕榈油、葵花子
14、油等可促进 PG 的合成，最高达 790 mg/L，表明 PG 合成与胞外生物表面活性剂的存在有关。在 YE 培养基中添加含吡咯环的脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸可显著促进 UP 的合成。当添加 10 g/L 的脯氨酸时，产量可达 2.5g/L。 Cang 等 26从土壤中分离获得一株沙雷菌 S389，以乙醇为唯一碳源， PG 产量最高可达 2.95 g/L。 Giri 等 27在黏质沙雷菌的培养基中分别添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，均能显著增加 PG 产量，其中以添加花生籽粉最为显著，达到 38.75 g/L。 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 PG 的生物合成途径及其调节， 1
15、983 年 Feitelson等 28克隆了天蓝色链霉菌与 PG 合成相关的基因簇， Thomason 等 29则首次将分离得到的 Serratia PG生物合成基因转入欧文氏菌（ Erwinla carotovora）质粒，成功表达并得到了 PG。 1-二羟吡咯 -5-羧酸还原酶催化合成脯氨酸的最后一步，该酶由 proC 基因编码。对链霉菌来说，脯氨酸是合成灵菌红素的前驱物质。 Barona-Gmez 等 30研究发现多拷贝 proC 基因可使链霉菌 A3(2) 产生灵菌红素，但是删除该基因却不会引起脯氨酸缺陷型的突变。 streptorubin B (cyclic)和十一烷基灵菌红素的合成
16、在动力学上有着一定地联系。 Jeffery T. Davis31研究发现灵菌红素具有可作为单质子配体与阴离子结合，包 括 Cl-和 HCO3-。它可以穿过磷脂双分子层，具有很强跨膜阴离子载体功能，可成为 HCl 的协同转运体 。 随着生物操作技术的发展和对 PG 的深入研究，人们将更加清晰地认识 PG 的产生和作用机制，大量生产制备 PG，用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害作用的化学药物，造福于人类。 参考文献： 1 Neil R. Williamson, Peter C. Finian J, Leeper P.C.Salmond. The biosynthesis and regulati
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