1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 熊果苷中间体单乙酰对苯二酚的制备 1 熊果苷概论 熊果苷作为一种天然存在的化学物质，首次发现于熊果属的植株叶子中。该属植物主要分布于西欧、北美一带，国内未有其分布的报道。以后的研究发现，在杜鹃花科、蔷薇科以及虎耳草科等不同属种的植株中也发现有熊果苷的存在。 熊果苷化学名称为对羟基苯 -D-吡喃葡萄糖苷，分子结构如图 l 所示。 其药理活性报道有利尿、抗菌并与可待因 (codeine)具有等效的镇咳效果 1,2。自 20 世纪90 年代以来，研究者发现熊果苷作为酪氨酸酶的抑制剂，能阻断 多巴以及多巴醌的合成，从而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且对皮肤没
2、有刺激性，毒副作用小 3。熊果苷作为美白剂广泛应用于化妆品中，国内外市场需求十分巨大，是美白祛斑类化妆品的首选主要原料。 2 熊果苷的药理作用 2.1 抑制黑素的生成 黑素是深色素类物质的一种，能引起皮肤的着色，是在黑素细胞（ Melanocyte）中由苯丙氨酸或酪氨酸经氧化等一系列生化反应生成的。熊果苷是酪氨酸酶抑制剂，它阻断多巴及多巴醌的合成，从而扼制黑素的生成。 1992 年 Daeda 报道了人黑素细胞培养中熊果苷去色素作用的机理 4。 结果表明，熊果苷抑制了培养人黑素细胞的酪氨酸酶活性 , 但该浓度下的熊果苷对细胞不呈现毒性。 熊果苷不影响酪氨酸酶的 mRNA 的表达。经电子旋转共振
3、（ ESR）光谱仪测定真黑素（ Eumelanin）自由基，确认熊果苷能有效地抑制黑素的生成。酪氨酸酶抑制动力学和机理的研究表明， 熊2 果苷作为这种酶的竞争抑制剂具有可逆性。用 L-酪氨酸和 L-多巴作底物的研究显示，这种机理涉及熊果苷与 L-酪氨酸在酪氨酸酶活性部位的竞争。以上结果表明， 熊果苷在人体中去色素机理涉及到黑素体中酪氨酸酶活性的抑制，而不是酪氨酸酶的表达和合 成。 2.2 临床应用 （ 1） 熊果苷具有利尿和抗菌活性 日本将熊果叶作为生药收入药典，但纯的熊果苷效果不佳。 （ 2） 熊果苷对免疫抗炎有协同作用 所用熊果苷来自熊果叶，研究它与氢化泼尼松或地塞米松对类型 IV 变态反
4、应诱导的免疫抗炎协同作用。结果表明，熊果苷能增强氢化泼尼松或地塞米松对苦基氯和羊红细胞延迟型过敏性的抑制作用 5。 3 熊果苷的 植被方法 已报道的熊果苷的合成方法主要有天然产物提取法 6、植物组织培养法 7、酶转化法 8和化学合成法 9,10。前三种方法由于产率低或者提取步骤复杂等原因 在目前状况下不适合工业化生产。现在市场上所供应的熊果苷大多是通过化学合成法生成。 3.1 天然产物提取法 主要利用铅盐法 11。其一般步骤是：含熊果苷的植物叶子采集加工一用乙醇或水作萃取 将萃取液过滤，并将过滤物洗涤，合并滤液 将滤液用饱和的中性乙酸铅水溶液处理，沉淀其中的有机酸、酚酸、鞣酸、黄酮类等成分，生
5、成不溶性铅盐沉淀 滤出沉淀，滤液用碱性铅水溶液使熊果苷生成非水溶性铅盐沉淀 滤出沉淀，悬浮于蒸馏水中，向悬浮液通入硫化氢气体，生成胶态的硫化铅沉淀，调节 pH，防止熊果苷水解 将硫化铅胶状沉淀用抽滤法抽 出，滤物水洗，合并滤液 将滤液减压浓缩，即可离析出满足化妆品之需的熊果苷晶体。 1996 年， Matsuda 等从六种熊果叶中得 50%乙醇提取物 12，进一步分离后得到熊果苷粗品，占熊果叶干重的 5%左右。 也可采用柱层析法。利用大孔吸附树脂分离等现代分离手段，从萃取液中得到熊果苷。但是这方面的研究未见报道。 熊果苷在熊果叶中的含量低，分离步骤繁多，提取物中熊果苷的纯度不高，故经济应用价值
6、不大。但是由于现代人追求纯天然绿色化妆品的理念，仍然有厂家从植物叶子中提取天然熊果苷，作为高档美白化妆品中的添 加剂。 由于含熊果苷的天然植物来源困难，近年来兴起利用植物细胞培养来生产熊果苷的研3 究。 3.2 植物组织培养法 该方法主要是利用植物细胞强大的糖基化能力，将外源氢醌转化为熊果苷。 1992 年，横山峰幸 13报道说，在长春花 (Catharanthus roseus)植物细胞培养悬浮液中加入氢醌，可制得熊果苷。该研究表明，细胞培养时间及添加氢醌的时机对产率的影响极大，该文献所报道的熊果苷最高产率为 9.2g/L。 林口能孝 14等利用长春花细胞培养法合成熊果苷。该方法将长春花细胞
7、在培养基中于暗 处摇床培养 8 天，过滤，将收集的细胞在新鲜培养基中再培养四天，新培养基中加入浓度为 22g/L 的氢醌水溶液，可得到 147mg 熊果苷 g(细胞干重 )。 在国内， 2001 年赵明强 15等研究者报道了应用人参毛状根细胞培养合成熊果苷的方法。该研究表明，培养 22 天的人参毛状根细胞更换含氢醌底物的培养基后，氢醌浓度为2mmol/L，持续转化 24 小时后，所合成的熊果苷占细胞干重的 13%，转化率可达 89%。该方法采用人参毛状根细胞合成熊果苷的优点是，终产物只需进行简单的处理即可添加于化妆品中，因为人参细胞本身也含有多种活性 物质，如人参皂甙等，适应化妆品的要求。以人
8、参细胞培养合成熊果苷为特色的丁家宣美白化妆品在市场上取得很大的成功。 利用植物组织培养法生产天然药物，是近来生物技术研究热点之一。它的优点是不受环境生态和气候条件的限制，增殖速度比整个植株栽培快很多。目前，利用植物细胞培养生产熊果苷，转化率较高，主要存在的问题是生产周期过长，有用物质含量较少，造成后续分离困难。对植物细胞生长的机理了解不够深入，往往是凭经验控制氢醌的添加时机。利用植物细胞培养合成熊果苷是今后研究热点之一。 3.3 酶转化法 该法主要以糖基转移酶或糖苷 酶作为催化剂，通过转糖基反应或逆水解反应合成熊果苷。 3.3.1 转糖基反应 Glycosyl-OR1+ R20H Glycos
9、yl -OR2十 H-OR 对于上述反应而言，酶底物为双糖或者多糖，发生糖基转移反应，离去基团为糖基，反应为动力学控制。水作为竞争性亲核物质，可发生水解副反应。 糖基转移酶能特异性地催化糖基从糖基供体如 UDP 衍生物转移到目标产物，该酶催化效率很高，但由于反应所需的糖基供体十分昂贵，因此它们在体外的应用很少。 4 1995 年， Ping Wang 等人报道 16说，利用从牛肝中提取 的葡萄糖苷酶，催化氢醌与对硝基苯葡萄糖苷之间的转糖苷反应，生成熊果苷。该反应能在 8 小时后使 65%的氢醌转化为熊果苷。转糖苷反应的效率很高，限制其大规模应用的原因是活性糖苷中间体对硝基苯葡萄糖苷过于昂贵。
10、3.3.2 逆水解反应 Glycosyl-OH+ R1OHGlysoyl -OR1+ H20 对于上述反应而言，当酶底物为单糖时，发生可逆水解反应。该反应是热力学控制。 -葡萄糖苷酶能催化合成单一异构体的糖苷。通过控制反应条件，可在非水相中催化糖苷水解酶逆水解反应合成糖苷，该方法是舍成且一葡萄糖苷 特别有吸引力的方法。 1993 年，下出绫子等人报道 17说， 30%(质量体积 )的葡萄糖溶液和 10%(质量体积 )的氢醌溶液，用 -葡萄糖苷酶催化，在 pH5 以及 40 环境下保持 72 小时，得 0. 11%的熊果苷。 1994 年，荒川博邦 18等人利用商品纤维素酶 Tamano 将氢醌
11、与纤维素转化为熊果苷。据其报道， 7%（质量体积）的氢醌和 5%（质量体积）的滤纸粉，在该酶作用下， 40培养 96 小时，得到 8mg 熊果苷与 5mg 氢醌 -O-D 纤维二糖。 总体来说，有关非水相中糖苷酶逆水解反应合成熊果苷的相关文献 不是很多，所得熊果苷的产率也较低。这可能是由于氢醌的对羟苯基的空间位阻效应比较大，同时由于反应物在有机溶剂中的溶解度比较小，阻碍了熊果苷的生成。 通过非水相中逆水解法酶法合成熊果苷只需要一步反应，且能保持反应物的立体构型，不需要进一步拆分，因此可以大大节省后续提取成本。该方法发展潜力巨大。找到合适的酶源以及提高逆水解合成的收率是今后研究的重点。 3.4
12、化学合成法 该法主要以葡萄糖与氢醌为原料，通过化学法合成熊果苷。化学合成法采用经典的Koenigs-Knorr 反应，即将葡萄糖乙酰化再经过溴取代后得到溴代 四乙酰葡萄糖，然后再与单侧链保护氢醌在碱性催化剂作用下缩合得到五乙酰葡萄糖，脱乙酰基得到熊果苷。反应过程如下图所示： 最早关于熊果苷化学合成的报道 19是应用溴化银，喹琳为催化剂，溴代四乙酰葡萄糖5 与氢醌单苄酯缩合，再经脱乙酰基和苯甲酰基制得熊果苷。该方法由于试剂较贵，反应步骤较多，已不常用。 邵颍 20等人报道了以三氯氧磷为催化剂，五乙酰葡萄糖与氢醌单苄基醚缩合，再经脱乙醚基团，苄基制得熊果苷。该方法由于其关键反应试剂对苯甲氧基苯酚需
13、自己合成，且产率不高，限制了该法的进一步发展。 李雯等人报 道用相转移催化剂合成熊果苷 21。该方法利用溴代四乙酰葡萄糖与单乙酰氢醌，经相转移催化得到五乙酰熊果苷，再经甲醇钠一甲醇体系脱保护基后得到熊果苷。该方法的关键步骤是单乙酰氢醒的合成，控制反应体系中氢醌与乙酸酐的物料比，是反应成功的关键。另有应用有机锡化合物脱乙酰保护基的报道。 化学法合成熊果苷都需要加保护基团和脱保护基团的步骤。但是利用化学法合成相对而言收率较高，成本较低，是市场上大部分熊果苷的来源。 4 结果和讨论 我国对合成熊果替的研究报道不多，在熊果苷的合成与生产方面，与国外相比还存在一定的差距。然 而，随着人们生活水平的不断提
14、高，保健意识和审美意识的不断提高，熊果苷的应用领域将逐渐拓宽，社会对熊果苷的需求量也将不断上升。这将有力的推动我国熊果苷及其衍生物合成方法的深入研究。 参考文献 1 Froluce D. Uinary disinfectant activity of bearberry lealf extacts J. Planta Med1969，18(1):1-25. 2 Straprova A, Tohodar L, Nosalova G. Antissive effect of taibutic J. Pharmazine, 1991, 46(8):611-612. 3 Meada K, Fukuda
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19、19(1):153-156 13 Yokoyamo Manufacture of glycosides of phenols by plant tissue cultureP.日本公开专利 平 4-131091 14 Yokoyarno. Manufacture of phenols glycosides by plant tissue culture with antioxidants P.日本公开专利 平 3-259091 15 赵明强 ,丁家宣 ,划峻 ,胡波 .人参毛状根生物合成熊果苷的研究 J.中国中药杂志 ,2001,26(12)819-821 16 PingWang, Brett
20、D, Martin, Sangamitra Parida.Multienzymatic synthesis of Polyhydroquinon for use as a Redox Polymer J.J.Am.Chem.Soc, 1995117, 12885-12886 17 Noguchi N, Horichi T. Manufacture of arbutin with -glucosidase from glucose and hydroquinone P. 日本公开专利 平 5-176785 18 Shimode A. Phenol glycoside manufacture with maltose phosphoryla. P 日本公开专利 平8-173183 19 Alexander R. J. Chem SocJ, 1930,2729-2733 20 邵颍 ,汪霞 ,孔荣祖 .熊果苷的合成 J.江苏化工 ,1996, 24 (2) 24-25 21 李雯 ,刘宏民 ,章亚东 ,孟腾 .熊果苷的相转移催化合成法 J.郑州工业大学学报 ,1999,20 (2) 42-44
