1、 本 科 毕 业 论 文 题目： UV 诱导大肠杆菌抗鲎素 菌株筛选 系 别： 生物工程系 专 业： 生物技术 姓 名： 学 号： 092408149 指导教师： 2012 年 5 月 18日 河南城建学院生物工程系毕业论文 目 录 摘 要 . i ABSTRACT . ii 一 文献综述 . 1 1.1 鲎的分类及地理分布 . 2 1.2 鲎的形态结构及药用价值 . 2 1.2.1 外部形态 . 2 1.2.2 内部构造 . 2 1.2.3 鲎的药用价值 . 3 1.3 鲎血淋巴抗菌肽 . 3 1.3.1 鲎素的抗微生物和抗菌活性 . 4 1.3.2 抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的作用
2、. 4 1.3.3 鲎试验法 (细菌内毒素检查法 ) . 6 1.3.4 鲎素抗菌肽抗菌机理 . 6 1.4 物理诱变技术 . 7 1.4.1 紫外照射 . 7 1.4.2 电离辐射 . 8 1.4.3 离子注入 . 9 1.4.4 激光 . 9 1.4.5 微波 . 10 1.4.6 空间技术诱变 . 10 1.5 化学诱变 . 10 1.5.1烷化剂 . 11 1.5.2 碱基类似物 . 11 1.5.3无机化合物 . 11 1.5.4 其他 . 12 二 材料与方法 . 13 2.1材料 . 13 2.1.1 试验材料 . 13 河南城建学院生物工程系毕业论文 2.1.2 主要仪器设备
3、. 13 2.1.3 主要试剂 . 14 2.2 技术路线 . 14 2.3 实验步骤 . 14 2.3.1 生长曲线的测定 . 14 2.3.2 紫外线诱变 . 15 2.3.3 浓度梯度法筛选抗鲎素菌株 . 15 2.3.4药敏试验 . 16 2.3.5 耐药稳定性测定 . 16 三 结果与分析 . 17 3.1 大肠杆菌 ATCC25922 和 JM109生长曲线的测定 . 17 3.2 紫外光诱变最佳照射时间的确定 . 18 3.3 梯度梯度法筛选抗鲎素菌株 . 20 3.4 药敏试验 . 20 3.5 耐药稳定性测定 . 20 四 讨论和结论 . 21 4.1 讨论 . 21 4.1
4、.1 大肠杆菌生长曲线的测定方法的探讨 . 21 4.1.2 紫外线诱导细菌的探讨 . 21 4.1.3 药敏试验 的探讨 . 22 4.2 结论 . 22 参考文献 . 24 致谢 . 31 河南城建学院生物工程系毕业论文 i 摘 要 中 国鲎鲎素 I(Tachyplesin-I)是从古老的海洋生物中国鲎(Tachypleus tridentatus， Chinese horseshoe crab)血细胞中分离纯化的一种小分子多肽。现已证实中国鲎鲎素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。 本实验以大肠杆菌 ATCC25922 和 JM109为出发菌株，通过紫外线诱变技术对原始菌株进行诱变，
5、并通过鲎素浓度梯度对大肠杆菌进行初筛，采用微量稀释法研究鲎素对初筛的菌株的最小抑菌浓度 ， 以得到抗鲎素的大肠杆菌菌株。 实验结果表明： 1、通过紫外分光光度计检测 波 长为 600 nm 下 不同培养时间的菌液 的 吸光度， ，得到大肠杆菌的生长曲线，在培养 2 12h时均呈现上升趋势，依次经历迟缓期、对数期、到达稳定期。 2.采用紫外线诱变处理的方法，对大肠杆菌 ATCC25922和 JM109进行处理；大肠杆菌 ATCC25922 和 JM109菌株在照射时间为 90s、 120s、150s的菌种致死率均 90； 在紫外诱变 60s时 的菌落大小明显变大。 3、通过微量稀释法测得鲎素对大
6、肠杆菌 ATCC25922 和 JM109 原始菌株 的最小抑菌浓度分别为 5g/mL、 10g/ mL， 最小杀菌浓度分别为 20g/mL 、 40g/mL 。 4、采用紫外诱变和鲎素浓度梯度筛选的的方法，从中筛选得到低抗鲎素的大肠杆菌 ATCC25922突变菌株 ATCC25922-A1-90、 E.coli ATCC25922-A2-90 、 ATCC25922-A1-60 3 株 。 诱 变 的 大 肠 杆 菌ATCC25922-A1-90和大肠杆菌 ATCC25922-A1-90菌株与亲本大肠杆菌ATTCC25922 菌株 的最小抑菌浓度 相比较，其抗药性提高了 2 倍 ，大肠杆菌
7、ATCC25922-A1-60其抗药性提高了 4 倍。 对 其筛选到的大肠杆菌 ATCC25922 突变菌株进行 连续 在多少抗鲎素浓度上进行连续 转接12 代， 其最小抑菌浓度无变化。 5、对于大肠杆菌 JM109 菌株 经过紫外线诱变 后， 一部分 发生了负突变， 变更为更敏感的菌株和一部分未变化的菌株 ，未诱导出抗鲎素菌株。 河南城建学院生物工程系毕业论文 ii 关键词： 鲎素 紫外线 最小抑菌浓度 抗药菌株筛选 ABSTRACT Tachyplesin-I, a cationic peptide consisting of 17 residues,was isolated from a
8、cid extracts of horseshoe crab (Tachypleus tridentatus,Chinese horseshoe crab) hemocyte debris. Tachyplesin-I acts as antimicrobial peptide It has a strong antimicrobial effect on the growth of Gram-negative R-type bacteria and shows antivirus and antitumor activity. To screen the ideal resistant st
9、rain to Tachyplesin-I, our research treated E.coli ATCC25922 and JM109 with ultraviolet mutation. By calculation lethality rate of different mutation time, we choose a certain lethality rate escherichia coli to see itre resistance to Tachyplesin-I of the concentration gradient. The MIC of Tachyplesi
10、n-I is detected by the method of microdilution inhibition of E coil. The experimental results indicated that: 1.By gathering The OD600 nm of E. coli, we get the growth curve through which we can see that during the 2-12h of cultivation. The cell density is climbing, and then it went into the period
11、of Delay period, logarithmic phase, and stable phase. 2.E. coli ATCC25922 and JM109 treated with ultraviolet mutation . The lethallty rate when both of them exposured to ultraviolet last 90、 120 or 150s are higher than 90 and those treated with 60s exposure the colony of which becomes obviously bigg
12、er than before . 3.The MIC of the Tachyplesin-I detected by microdilution inhibition of E.coil ATCC25922 JM109 was 5g/mL,10g/mL, respectively.And the MBC was 20g/mL,40g/mL, respectively. 4.ATCC25922-A1-90, E.coli ATCC25922-A2-90 and ATCC25922-A1-60, three strain of E.coli, having low resistance to T
13、achyplesin-I, were screened out and isolated through UV induction and concentration gradient.The resistance of E.coli ATCC25922-A1-90 and E.coli ATCC25922-A2-90 was at least 2 times than parent of ATCC25922. And the resistance of E.coli ATCC25922-A1-60 was at least 4 times 河南城建学院生物工程系毕业论文 iii than t
14、he parent of ATCC25922. Growth rate and ability of resistant strain E.coli ATCC25922-A1-90 and ATCC25922-A2-90 was similar to ATCC25922.The resistance was still unbroken after transferring of culture twelve times continuously.Part of the JM109 which is treated with ultraviolet becomes more sensitive
15、 , While the others remained unchanged. KEYWORD： Limulus； Tachyplesin I ； ultraviolet ray ； minimal inhibitory concentration； minimum bactericidal concentration 河南城建学院生物工程系毕业论文 1 一 文献综述 21世纪人类社会面临着“人口剧增、资源匮乏、环境恶化 “三大问题的严峻挑战。随着陆地资源的日益减少，开发海洋资源变得日益迫切。海洋生物的生活环境与陆地生物有很大差异，海洋生物生活在高盐、高压、低温、低营养和有限光照等特殊的生态环
16、境中，各种海洋生物依其特殊的结构和功能维持其生命活动。海洋生物的多样性、复杂性和特殊性使源于其中的海洋天然产物也具有多样性、复杂性和特殊性，这正为寻找海洋生 物活性物质提供了丰富的物质来源。 伴随着抗生素药物的滥用及残留，导致了许多细菌，尤其是致病菌的抗生素抗药性问题日益严重。耐药性超强的“超级细菌”的出现更加重了人们对抗生素使用的担心，细菌的抗药性已成为困扰 21世纪人类医学、养殖业和食品安全的世界性难题，迫切需要产生一种新的抗菌药物来替代抗生素。而抗菌肽（ Antimicrobial peptides, AMPs）是生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一类小分子多肽。到目前为止，已分离
17、到的 AMPs有 1200多种， AMPs已广泛应用于转基因动植物、药物开发、临 床治疗、食品防腐剂与饲料添加剂等领域，并显示出良好的应用与发展前景。 随着对 AMPs研究的深入 ， 发现细菌也同样会对某些 AMPs产生抗药性 1-3。 关于细菌是否易于对鲎素产生抗药性尚不太清楚，因此我们急切地想知道，与普通的细菌对鲎素的耐受性相比，鲎素能否对理化因素诱导处理的细菌更易产生抗药性？如果更易产生抗药性，一方面，我们可以通过比较出发菌株与理化因素诱变后细菌的不同，来进一步了解鲎素的杀菌机制和抗药性机制；另一方面，对于筛选出来的抗药菌株（大肠杆菌），可以作为工程菌株进行转基因鲎素表达。 鲎素（ Ta
18、chyplesinI）是 1988年由 Nakamura 等人从中国鲎血细胞的酸性提取物中分离出来的一种具有典型环状 -折叠结构的 AMPs，由 17 个氨基酸残基构成 4。研究发现，鲎素具有广谱抗菌活性，可抑杀细菌、真菌、病毒和原虫，还具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的作用 5-13。 本实验通过紫外线诱导大肠杆菌 ATCC25922 和 JM109 菌株，并利用梯度平板法筛选出抗鲎素菌株，如果可以诱导出抗鲎素菌株，一方面，我们可以通过比较出发菌株与理化因素诱变后细菌的不同，来进一步了解鲎素的杀菌机制和抗药性机制；另一 方面，对于筛选出来的抗药菌株（大肠杆菌 ATCC25922 和 JM
19、109），可以作为工程菌株进行转基因鲎素表达。因此抗鲎素菌株的筛选具有较大的理论意义和实际的应用价值 。 河南城建学院生物工程系毕业论文 2 1.1 鲎的分类及地理分布 鲎，又称马蹄蟹、王蟹，是一种从古生代的三叶虫演化而来的低等无脊椎海洋动物属于节肢动物门 (Arthropoda)、有螯亚门 (Chelicerta)、肢口纲(Merostomata)、剑尾目 (Xiphosura)、鲎科（ Limulidae)。鲎的种类很少，分布狭窄，根据其形态和分布特点，可分为二亚科三属四种 14-15。现存的鲎仅有 4种，即美洲鲎 (Limulus polyphemus)、中国鲎 (Tachypleus
20、tridentatus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎 (Tachypleus gigas)16。 鲎是一种栖身于海洋，血液呈蓝色的节肢动物，鲎的分布比较狭隘，主要分布在北美、东亚及东南亚一带 1；欧洲只发现了一些鲎的化石但是还没有发现活的鲎。美洲鲎 (Limulus polyphemus)主要分布于大西洋沿岸；中国鲎 (Tachypleus tridentatus)主要分布于广西、广东、福建、海南等地；圆尾鲎 (Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎 (Tachypleus gigas)主要分布于东南亚一带 17-22
21、。 鲎除具有动物“活化石”称号外，鲎又冠有“无脊椎动物献血冠军”的美誉，其体内拥有大量的血淋巴。 一只成年鲎可制备 100 300mL血，血淋巴采集也较为便利，而且鲎的凝血系统与哺乳动物的非常相似，因此鲎是无脊椎动物血液学研究的绝好材料，也是目前鲎资源开发利用和鲎试剂研制的主要原材料，一直受到日、美等国学者的高度重视”。近年来 ，随着对鲎血淋巴的免疫功能研究及其与其它无脊椎动物血淋巴的免疫学比较研究，尤其是从鲎血淋巴中分离出许多具有抗菌、抗病毒的活性物质，鲎血淋巴研究已成为当前无脊椎动物免疫学研究的重要热点领域 23-25。 1.2 鲎的形态结构及药用价值 1.2.1 外部形态 鲎体长可达 6
22、O厘米以上，身体可分为头胸部、腹部和剑尾三部分。头胸部由坚硬的几丁质头胸甲所包裹，头胸甲背面呈碗状隆起，前缘左、右侧缘呈半圆形，两侧后端部向后突出成尖刺状。头胸甲前部有一对单眼，单眼后部两侧各有一只复眼。 头胸甲与腹甲交接处有关节，这一关节可 使腹部稍向前屈曲。体末端伸一长剑状的尾刺，是其被称为剑尾类的原因，尾剌能使身体翻转。头胸甲腹面有 6对附肢。腹甲腹面有 6对覆板状的附肢 26-29。 1.2.2 内部构造 河南城建学院生物工程系毕业论文 3 口位于头胸部腹面 6对附肢的基部。后有食道、前肠、肠、直肠、肛门。消化腺为中肠腺，填充于身体内大部分。循环系统相当复杂属开管式循环系统。心脏位于中
23、心线，附腔基部、剑尾基部有发达的肌肉。 鲎雌雄异体，雌体的生殖腺特别发达，成熟时，占据体腔大部分。一对生殖孔开口于盖板基部 26-29。 1.2.3 鲎的药用价值 对鲎的记载最早是我国的吴都 赋 (周氏编于公元 276 324年 )。饲料本草（陈章奇编于公元 739年），本草纲目拾遗及李时珍的本草纲目中对鲎均有记载。其中，本草纲目中提到，鲎壳治积年呷嗽。本草纲目拾遗中提到：越尾灰断产后痢 26。 鲎的肉可明目，治青光眼，脓泡疮；壳可活血祛瘀、解毒、治高热治跌打损伤、治创伤出血、治烫伤、治带状疱疹、治胃炎；胆可用于治大风癫疾、杀虫、解毒等；珠可用于咽喉肿痛；尾可用于治肺结核咯血、疮疥 26。 1
24、.3 鲎血淋巴抗菌肽 鲎素（ Tachyplesin I）是 1988年由 Nakamura等 4人于 1988年从中国鲎（ Tachypleus tridentatus）血细胞的酸性提取物中分离出来的一种具有典型环状-折叠结构的 AMPs，由 17个氨基酸残基构成，其中含有 5个精氨酸，不含酸性氨基酸和己糖胺，相对分子质量为 2263，其化学结构为： (Nakamura et aL. 1988)。 鲎素含有 2 个二硫键，分别位于 Cys-3 和 Cys-16 及 Cys-7 和 Cys-12 之间。 目前发现的五种鲎素 (Tachyplesin I、 Taehyplesin II、 Tac
25、hyplesin III、Polyphemusin I、 Polyphemusin I 大部分氨基酸替代发生在 Arg 和 Lys 之间，其一级结构如下： Tachyplesin I K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH； Tachyplesin II R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I- C-Y-R-K-C-R-NH； Tachyplesin III K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G I-C-Y-R-K-C-R-NH； Polyphemusin I R-R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-F-C-Y-R-K-C-R-NH； Polyphe
26、musin II R-R-W-C-F-R-V-C-Y-K-G-F-C-Y-R-K-C-R-NH 30-31。 NH2-K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-CONH2 河南城建学院生物工程系毕业论文 4 1.3.1 鲎素的抗微生物和抗菌活性 体外实验表明，鲎素在较低浓度下就可抑制革兰氏阴性菌 (大肠杆菌、绿脓杆菌 )和革兰氏阳性菌 (枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 )的生长，其中以葡萄球菌对鲎素的反应最为敏感，其最小致死剂量为 10g/mg32。陈小芳等用酸处理和Sephadex G-50 凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提 取分子量约为 3KD的鲎素，加入菌液培养，
27、24h后侧定发现，鲎素显著抑制大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌的生长，其 24h最小有效抗菌浓度分别为 0.23、 0.23和 1.88g/mL33。刘慧明等用酸处理和 Sephadex G-50 凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提取的鲎素，加入菌液培养， 24 h后侧定发现，隐球菌，枯草杆菌的最小抑制浓度分别为 2.28g/mL和45g/mL34。张海涛等采用酸抽提法和 Sephadex G-50 凝胶层析从鲎血细胞中分离出含有一低分子量组分的提取物， SDS-PAGE显示一条 区带。提取物可以抑制内毒素诱导的鲎试剂（ TAL）反应，抑制金色葡萄菌和大肠杆菌的生长，其中最小抑菌浓度：金黄葡萄球菌为
28、15mg/L, 大肠杆菌为 25mg/L，并发现 25mg/L的提取物对 HL-60细胞的生长有强烈的抑制作用 35。 L 1.3.2 抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的作用 中国鲎素能有效地抑制癌细胞的增殖活动，具有与癌细胞诱导分化物相似的抗肿瘤效果。李祺福等应用从中国鲎血液中提取的鲎素处理人胃腺癌 BGC-823细胞，研究鲎素对胃癌细胞形态和超微结构的影响。光镜观察显示经 2.0g/mL鲎素处理 的 BGC-823 细胞形态较为一致，细胞体积增大，趋于扁平铺展状态，细胞核质比例变小，核仁数量减少、体积缩小；扫描电镜与透射电镜观察可见经鲎素处理后 BGC-823细胞表面微绒毛稀少，细胞边缘丝
29、状伪足减少，片状伪足增多；细胞核形态较规则，核内异染色质减少，常染色质增多；细胞质内线粒体数量增多，结 构较为一致，高尔基体呈较为典型发达状态，并出现粗糙型内质网增多和多聚核糖体减少等变化。表明鲎素能有效改变胃癌细胞恶性形态结构特征，从而对胃癌细胞具有一定的诱导分化作用 9。李祺福等用从中国鲎血细胞中提取的鲎素处理人胃 癌 BGC-823 细胞显示，经 2.0g/mL 鲎素处理的 BGC-823 细胞生长缓慢，倍增时间延长，细胞集落形成能力减弱，细胞生长抑制率达 62.67%，细胞分裂指数下降 40.91%；处理后细胞碱性磷酸酶细胞化学反应减弱、分布改变，碱性磷酸酶和乳酶脱氢酶活力分别下降 40.59%和 76.05%10。李祺福等用从中国鲎血细胞中提取的鲎素处理人肝癌 SMMC-7721 细胞表明，经 3.0g/mL 鲎素处理
