1、 本科毕业论文（设计） 题目：磷脂酶 D 发酵菌株的自然筛选及条件优化 学生姓名 _ 学 号 _ 指导教师 _ 院 系 化工学院 _ 专 业 _ _ 年 级 级 _ 教务处制 成绩 诚信声明 本人郑重声明：本人所呈交的毕业 论文（设计） ，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。毕业 论文（设 计） 中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。 特此声明。 论文作者签名： 日 期： 年 月 日 摘要 摘 要 磷脂酶 D(PLD)能催化水解卵磷脂 (PLs)释放出磷脂酸和 胆碱 ,在 乙醇等
2、物质存在的条 件下 ,PLD 能 进行碱基交换反 应 ,将具有羟基的乙醇等物质与胆碱的极性头部进行酯交换反应 ,连接到磷脂受体上。因此 ,具有碱基交换功能 的 PLD 通过对磷脂极性头部特异性基团 的改变 ,可以生成许多稀有或半合成磷脂 ,满足保健品、医药等方面的需要 。 PLD 广泛存在于细菌、真菌、植物、脊椎动 物中 ,特别是来源于链霉 菌的 PLD,表现出较好的水解及转酯活性。 本文以实验室初步筛选的 产 PLD 菌株为 出发菌株 ,首先 根据 PLD 反应的特点 ,采用薄板层析 (TLC)法 ,实现酶活力的快速测定。然后在此基础上对菌种进行自然 选育 ,摇瓶复 筛 ,建立了一套 PLD
3、 生产菌株的筛选方法。通过摇瓶 培养 ,对发酵培养基组分进行优化 ,确定了碳源、氮源和无机盐的最佳用 量和对实验的影响。 关键词： 磷脂 ;磷 脂酶 D;链霉菌 ;筛选 ;发酵 摘要 Abstract PhospholipaseD(PLD) is an enzyme that catalyzes PLs hydrolysis to release a phosphatidic acid(PA) and a choline.While in the presence of an additional alcohol,PLD preferentially catalyzes the transph
4、osphatidylation reaction,in which a polar-head modified phosphatidyl alcohol is synthesized by the substrate PLs that act as the phosphatidyl-moiety donors.The transphosphatidylation reaction carried out by the PLD enzyme should be,therefore,a powerful tool for achieving PL modifications economicall
5、y.As a fairly abiquitous enzyme,PLD is widely distributed in bacteria,fungi,plant and vertebrate species.Particularly,the PLD enzymes produced by Streptomyces species appear to much high activity. However,the wild strain of Streptomyces produces lower unit PLD,limiting its industrial production grea
6、tly.In this paper,a rapid determination of PLD enzyme based on the mechanism of the PLD reaction was firstly built with the Thin Layer Chromatography(TLC)method. Then on this basis to natural selection of species, shake flask after screen, established a set of PLD production strain screening method.
7、 Through shake flask culture, optimize the fermentation medium components, determine the amount of carbon source, nitrogen source and inorganic salts has a great influence on experiment. Keywords: phospholipids;phospholipase D; Streptomyces; strain screening; fermentation目录 目 录 第一章 文献综述 . 1 1.1 磷脂 .
8、 1 1.1.1 磷脂概述 . 1 1.1.2 磷脂的理化性质 . 1 1.1.3 磷脂的应用 . 2 1.2 磷脂酶 D . 2 1.2.1 磷脂酶 D 的简介 . 2 1.2.2 磷脂酶 D 的应用 . 3 1.2.3 磷脂酶 D 的催化活性 . 4 1.2.4 磷脂酶 D 反应的影响因素 . 4 1.3 薄层色谱 . 5 1.3.1 薄层色谱的简介 . 5 1.3.2 基本原理 . 5 1.3.3 展开剂的选择 . 6 1.3.4 薄层色谱法的一般操作程序 . 6 第二章 磷脂酶 D 发酵菌株的自然筛选 . 7 2.1 材料与仪器 . 7 2.1.1 菌种 . 7 2.1.2 主要仪器及
9、药品 . 7 2.1.3 培养基 . 8 2.2 实验方法 . 8 2.2.1 培养条件 . 8 2.2.2 纯化与 自然选育 . 9 2.2.3 酶液的制备 . 9 2.2.4 酶活力测定的方法 . 10 2.3 结果与分析 . 10 目录 2.3.1 LDO606 菌株的纯化 . 10 2.3.2 LD0606 出发菌株的平板初筛 . 10 2.3.3 摇瓶复筛 . 11 2.4 本章小结 . 11 第三章 磷脂酶 D 发酵产酶条件优化 .12 3.1 材料与仪器 . 12 3.1.1 菌株 . 12 3.1.2 仪器及设备 . 12 3.1.3 培养基 . 13 3.2 实验方法 . 1
10、3 3.2.1 培养条件 . 13 3.2.1 碳源对链霉菌发酵产酶的影响 . 13 3.2.2 氮源对链霉菌发酵产酶的影响 . 13 3.2.3 无机盐对链霉菌发酵产酶的影响 . 14 3.3 结果与分析 . 14 3.3.1 葡萄糖浓度对磷脂酶 D 发酵产酶的影响 . 14 3.3.2 氮源浓度对磷脂酶 D 发酵产酶的影响 . 15 3.3.3 NaCl 浓度对磷脂酶 D 发酵产酶的影响 . 15 3.3.4 MgSO4 浓度对磷脂酶 D 发酵产酶的影响 . 16 3.4 本章小结 . 17 参考文献 .18 致 谢 .19 西北大学论文 1 第一章 文献综述 1.1 磷脂 1.1.1 磷
11、 脂概述 磷脂由 Uauqueelin 于 1812 年首次发现，法国人 Globly 在 1844 年从蛋黄中首次分离出磷脂，俗称卵磷脂（ Lecithin） 1 。 从广义上说，磷脂酰胆碱（ Phosphatidylcholine，简称 PC）、卵磷脂含脑磷脂（磷脂酰乙醇胺， Phosphatidylethanolamin，简称 PE）、磷脂酰丝氨酸（ Phospstidylserine，简称 PS）、磷脂酰肌醇（ Phosphatidylinositol，简称 PI）以及神经鞘磷脂（ Springmyelin，简称 SM）的复合磷脂；从 狭义上讲的卵磷脂即磷脂酰胆碱 PC，它是胆碱、甘油
12、、磷酸、饱和及不饱和脂肪酸组成的含磷脂类物质 2 。 1.1.2 磷脂的理化性质 卵磷脂的纯净品为白色蜡状固体，在低温下可结晶。磷脂分子中含有大量的不饱和脂肪酸，在空气中卵磷脂易被氧化形成过氧化物聚合物，此时磷脂由白色转成黄褐色，然后会变为棕黑色。卵磷脂不耐高温 ,在 100 以上就会氧化分解。因此，卵磷脂需在低温干燥的条件下保存，勿放置在有阳光直射或者潮湿、高温的地方，以防止其吸潮、氧化以及分解变质等 3。 磷脂分子含有疏水性脂肪酸基和亲水性磷酸脂基 ,人们通 常把磷脂归为一种具有两性（ amphoteric）特征的表面活性剂。磷脂不溶于水但与油脂完全混溶 ,且其易吸水膨胀成为胶体。磷脂均不
13、溶于或难溶于丙酮 ,故称其为丙酮不溶物。磷脂可以被酸、碱、酶等水解，由于不同的磷脂在如乙醚、氯仿、乙醇等的有机溶剂中的溶解度不同 ,用这些有机溶剂可以实现卵磷脂的提取分离 4。 磷脂是构成神经组织、尤其是脑脊髓的主要成分 ,也是生命细胞和所有活细胞的重要组成部分。磷脂既是血球及其它细胞膜的主要构成材料 ,也组成 40%的西北大学 论文 2 人的骨髓、大脑中的干物质。在正常的血液中磷脂占总脂量的 25%，在人体 正常活动的新陈代谢中 ,磷脂是不可缺少的。 1.1.3 磷脂的应用 作为一种既含疏水基团又含有亲水基团的良性的表面活性剂，磷脂具有良好的乳化性能，在巧克力、糖果、焙烤食品、乳品等领域中已
14、有很广泛的应用。在食品工业中，把其它乳化剂与磷脂结合使用以对食品起到乳化作用；通过将其与淀粉、蛋白质结合来改良食品的物理性质 ,从而提高产品营养价值和质量并改良口味；磷脂和维生素 E 结合可以调制成不同品种、不同形式、不同功效的功能性食品 3。 由于磷脂能够分解过高血脂及胆固醇并起到清扫血管、促进血液循环而减低脂肪肝的发病率的功能和 作用等，在一定程度上磷脂起到延缓衰老、维持机体健康年轻 ,强化脑部功能、增强记忆力的作用。此外，磷脂可以保护胃的黏膜。并对生物膜中的许多酶的活性有影响。医药工业方面，磷脂在人体细胞膜中不可缺少 ,人体脑部神经信息的传递中发挥了作用，对人的记忆力有很大影响；磷脂可以
15、降低胆固醇等 , 从而缓解存在高血脂、血压的糖尿病等；此外，在一些酶的作用下 , 在油 -水界面中磷脂反应可以合成新的药品。 在化妆品工业中，卵磷脂对人体皮肤良好的渗透性及适应性从而具有的促使皮肤柔软有弹性的性能；卵磷脂可化解人体肠内的废物，避免后者成为肠毒进入血液循环造成肌肤问题，磷脂也得到了广泛的应用。 除上述应用外，在农作物的防除剂、液体饲料制备过程的润滑剂及纺织工业的加工等其它工业中，磷脂也有广泛的应用前景。 1.2 磷脂酶 D 1.2.1 磷脂酶 D 的简介 磷脂酶是一种微生物酶 , 具有较高的催化活性和高度的专一性。磷脂酶可以分为磷脂酶 A1、磷脂酶 A2、磷脂酶 C、磷脂酶 D
16、等。磷脂酶 D（ phospholipase 西北大学 论文 3 D），简称 PLD，可以对磷脂进行体外酶法改性，能催化水解羟基化合物 P-O 键和磷脂分子中的磷酸，生成磷脂酸 (PA)和亲水性的胆碱，是特殊的一类酯键水解酶。另外 ,在特定的条件下，有含羟基化合物（如甘油、丝氨酸、醇类物质等）时，可催化其结合到磷脂的碱基上形成新的磷脂 ,这就是 PLD 的转磷脂化反应（ Transphosphatidylation reaction)，也称作碱基交换反应（ Base exchange) 5。 继 1947 年研究人员提取胡萝卜根首次发现了有活性的 PLD，人们逐渐发现磷脂酶 D 主要存在植物体
17、的根、叶中和动物体的脑髓、肝脏等细胞中。传统工业大多以植物组织作为主要原料制备 PLD。由于动植物体中的 PLD 含量低 ,无法实现大规模生产。而微生物中存在 大量的 PLD 的发现解决了这一问题。 PLD主要存在于链霉菌及大肠杆菌中 ,可以对菌株大规模发酵培养来产酶。微生物PLD 与植物来源的 PLD 相比较，具有高度的专一性、较强的底物耐受性和碱基交换催化活性。产 PLD 的微生物种类主要有棒状杆菌、链霉菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏杆菌以及嗜血副流感菌等，其中链霉菌酶活较高 6。 1.2.2 磷脂酶 D 的应用 磷脂酶 D具有磷脂转移性和高度专一性两个特点 ,所以对来源广泛的粗品磷脂进行
18、转化 ,就可以得到一些稀有磷脂 ,既开发出了新品种 ,又提高磷脂的营养价值。在磷脂酶 D 的作用下 ,对 磷脂进行改性 ,可以合成其他的稀有磷脂 ,从而使其的营养价值、各种性能等方面大大改进和提高 ,这就使磷脂在食品、医药、化妆品、纺织、皮革技术工业中的应用范围更加广泛 ,使用价值更高。 如食品工业中，磷脂酶 D 在丝氨酸存在下催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸（ PS） ,还可以制备磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等 ;此外 ,还可用纯度低的卵磷脂制备出高纯度的卵磷脂。脂酶 D 在农业上也大有作为 ,它存在于植物体中 ,它的减少标志着果实的衰败 ,从而影响了产量及收成 ,可见如果增加磷脂酶 D 的含量 ,不
19、仅可以延长果实的寿命 ,而且在经济效益上也大有收获。 在医 药工业中 ,利用磷脂酶 D制备的高品质磷脂及其衍生物的应用潜力和价值极为突出。首先 ,脂质体技术为药剂的输送与传递提供了一种有效工具。各类高品质磷脂及其衍生物是脂质体药剂最为重要的辅料 ,一定程度上决定了脂质体西北大学 论文 4 技术的发展水平。同时 ,也可以利用磷脂酶 D 的碱基转移活性将一些 多肽 、核 苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上 ,制成具有特殊疗效作用的脂质体。其次 ,利用磷脂酶 D 还可合成一些抗肿瘤试剂。 1.2.3 磷脂酶 D 的催化活性 PLD 由于其催化反应的特殊性，受到人们的高度关注，除了水解磷脂的作用
20、之外， PLD 在合适的条件下 还能催化各种含羟基的底物结合到磷脂的碱基上，形成新的磷脂。 PLD 的催化反应机理如图 1.1 所示： 图 1-1 PLD 催化磷脂碱基交换反应和水解反应 可见 PLD 的催化作用取决于反应体系中水的含量。大量的水存在会使反应朝着水解的方向进行，生成副产物磷脂酸（ PA,Phosphatidic acid)。为了抑制水解反应的发生，后来对 PLD 磷脂转移特性的研究多采用微水或无水介质作为反应体系。多数关于 PLD 催化磷脂反应的研究都是在有机相 -水微乳体系中进行。其中底物和产物能够很好的溶解在有机溶剂里，酶和羟基化合 物溶于水中，反应在两相间的界面上进行 7。 1.2.4 磷脂酶 D 反应的影响因素 影响磷脂酶 D 反应的因素很多 ,如温度、 pH、盐类、有机溶剂以及反应所处的相。不同来源的磷脂酶对温度、 pH 所产生的影响不同。一般来说 ,大多数磷脂酶 D 最适反应温度在 2540 之间 ,但也有部分来源的 PLD 最适温度在 5565之间。不同来源的磷脂酶 D 的最适 pH 也不相同 ,植物来源的 PLD 在酸性范围 ,一般在 56 之间 ,微生物来源的 PLD 范围较宽 ,在 48 之间。除温度、 pH 外 ,另一
