1、 本科毕业论文 题 目 弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 学 院 生命科学技术学院 专 业 生物技术（动物方向） 毕业届别 2014 届 姓 名 指导教师 副教授 研究员 甘肃农业大学教务处制 二 一 四年五月 目录 摘要 . 1 关键词 . 1 Abstract. . 1 Key words . 2 前言 . 1 1 实验材料 . 2 1.1 目的基因、质粒及菌株 . 2 1.2 主要实验试剂 . 2 2 方法 . 3 2.1 目的基因 ENO2 的扩增 . 3 2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定 . 4 2.3 克隆载体的构建 . 4 2.4 重组质粒的鉴定 . 6 2.5 重组质粒的诱导表达
2、 . 7 2.6 表达产物的 SDS PAGE 电泳检测 . 7 3 结果 . 7 3.1 ENO2 基因的 RT-PCR 扩增 . 7 3.2 pMD-ENO2 重组质粒的酶切鉴定 . 8 3.3 pET-ENO2 重组质粒的鉴定 . 9 3.4 ENO2 基因表达产物 SDS-PAGE 分析 .9 4 讨论 . 10 参考文献 （ Reference） : . 11 致谢 . 13 ：弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 1 弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 (1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070； ) 摘要 :弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，呈世界性分布，可感染
3、包括人类在内的所有脊椎动 物。弓形虫严重威胁人类的生命健康，危害公共卫生，对畜牧业的发展造成巨大损失。 烯醇化酶 (ENO1 , ENO2)为虫体不同时期的同工酶，具典型的期特异性， ENO2 主要出现于速殖子时期。 ENO2 特异性定位在胞核中 。本研究针对弓形虫 ENO 基因序列设计引物，采用 RT-PCR 技术从弓形虫 GJS 株的 cDNA 中扩 增ENO2 基因片段，构建重组质粒 pMD-ENO2。测序结果表明，获得的基因序列与 NCBI 已公布的序列相似性为 100%。将 ENO2 基因定向亚克隆至原核表达载体 pET-30a（ +） 中，并转化至大肠杆菌 BL21 中，经 IPT
4、G 诱导表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明， ENO2 基因在大肠杆菌中成功表达，以包涵体的形式为主，分子量大小约为 1 335 bp。本研究为下一步研制基于排泄分泌抗原的抗弓形虫重组疫苗奠定基础。 关键词： 弓形虫；烯醇酶 2；克隆；原核表达 Abstract: Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite, it has a worldwide distribution, and can infect all vertebrates, including humans. T. gondii has serious threa
5、t to human life and public health, and it causes huge losses to the development of animal husbandry. Enolase (ENO1, ENO2) is an isozyme which is exists in different periods of T.gondii, and it has typical specificity in different periods. ENO2 is mainly appeared in the tachyzoite. We designed primer
6、s according to ENO2 gene sequences of T. gondii, and ENO2 gene was amplified by RT-PCR from the cDNA of T. gondii GJS strain to construct a recombinant plasmid pMD-ENO2. Sequencing results showed that the gene sequence and NCBI published sequence similarity was 100%. ENO2 gene was subcloned and link
7、ed to prokaryotic expression plasmid pET-30a(+), transformed into E. coli BL21, and expressed by IPTG induction. Polyacrylamide gel electrophoresis identification showed that the ENO2 gene expressed successfully in E. coli, which gave priority to the form of inclusion body, and the size is about 133
8、5 bp molecular weight. This study lay a foundation for further development of anti-T. gondii recombinant vaccines, which are based on the secreted antigen. Key words: Toxoplasma gondii; ENO2; clone; prokaryotic expression 前言 ：弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 2 弓形虫 (Toxoplasma gondii)是一种专性细胞寄生性原虫，具有广泛的宿主群并在世界范围内流行
9、，引起人兽共患弓形虫病。弓形虫作为一种机会感染致病因子，可导致艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等免疫功能损伤或免疫功能抑制的病人死亡。弓形虫病不但是医学上的一种重要疾病，它还是影响人类优生优育的一个重要原因之一。怀孕妇女感染弓形虫，无论有无临床症状，一半左右可以发生母胎垂直感染，导致流产、死胎以及胎婴先天性缺陷或畸形 (形态上的畸形 ，功能上的智力低下 )等 1， 2， 3。怀孕动物感染弓形虫后出现流产、死胎，严重时，还可导 致宿主的死亡，给畜牧业造成巨大的经济损失。 弓形虫根据发育期不同，主要有 5 种形态结构，包括速殖子、包囊、卵囊、配字体、裂殖体。弓形虫烯醇化酶 (enolase， E
10、NO1, ENO2)为虫体不同发育时期的同工酶，具典型的期特异性， ENO2 主要出现于速殖子时期。研究表明， ENO 特异性定位在胞核中，但其高密度核染色仅限于胞内发育增殖的早期，但在弓形虫达到成熟阶段以后 (成熟包囊缓殖子、胞外速殖子、成熟裂殖体中的裂殖子、胞外裂殖子、小配子体中发育完全的小配子和大配子 )核染色降低，因此，我们认为该同工酶的核定位与核活性相 关，推测其在虫体发育增殖过程中存在基因调控作用。 近年来，对弓形虫的致病及免疫机理的研究成为研究的热点，对开发更加安全有效的疫苗成为弓形虫免疫预防的重要任务。弓形虫排泄分泌抗原（ excreted-secreted antigen,
11、ESA）是虫体在入侵宿主细胞及在细胞内增殖和细胞外游离过程中向血液、组织间隙、体腔液或培养上清液释放的可溶性抗原成分。目前，已经对 ESA 免疫效果进行大量研究结果均表明 ESA 是研制疫苗所需的最佳抗原之一 4， 5， 6。但 ESA 的组分复杂，起主要免疫作用的蛋白目前尚不可知。目前研究 表明， ENO2 是弓形虫 ESA 中的一种蛋白，参与弓形虫入侵及细胞内繁殖过程。本研究对弓形虫 ENO2 进行了克隆，并在 PET-30a 载体中表达， 为下一步研制基于排泄分泌抗原的抗弓形虫重组疫苗奠定基础。 1 实验材料 1.1 目 的基因、质粒及菌株 弓形虫烯醇化酶 2 基因， 大肠杆菌 DH5、
12、 BL21（ DE3）、 pET 30a 表达载体购自Novageng 公司； pMD 18T 载体购自大连宝生物。 1.2 主要实验试剂 DNA 提取试剂盒、 DNA 纯化试剂盒为英国 OMEGA 公司产品；凝胶回收试剂盒、 Taq ：弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 3 DNA 聚合酶、 dNTP、 T4DNA 连接酶、 Kpn ， Xho 、核酸 Marker、低分子量蛋白质 Maker为大连宝生物公司产品；质粒提取试剂盒为北京博大泰克公司产品； IPTG、 X-gal、 TEMED为上海生物工程公司产品；氨苄青霉素、卡那霉素、 SDS、 Tris 碱等均为华美公司产品；琼脂糖为丹麦
13、 UTEX 公司产品；丙烯酰胺、双丙烯酰胺为德国 Merck 公司产 品；胰蛋白陈、酵母提取物、琼脂为英国 OXoid 公司产品；其余试剂均为国产分析纯。 2 方法 2.1 目的基因 ENO2 的扩增 参照 GenBank 登载的基因的 ENO2 核酸序列 ,在其阅 读框外侧自行设计一对克隆引物，上、下游引物之间所扩增片断为 1 335 bp，引物交由大连宝生物公司合成。（下划线碱基分别为 EcoR I， Hind III 酶切位点）。 上游引物： 5 -CGGAATTC ATGGT GGCCA TCAAG GACAT CACTG CT-3 下游引物： 5 -CCAAGCTT TTAGT TG
14、GGA TGGCG GAAGC CAGCG CC-3 在 PCR 反应管中配制如下反应体系： TaKaRa Taq(5 U/L) 1.0 L 10 M PCR Buffer 12.5 L 模板 RNA 1.0 L 上、下游引物 (20 pmol/L)各 0.5 L 灭菌去离子水 9.5 L 反应总体积 25 L 混匀后置 PCR 扩增仪中， 95 预变性 2min 后进行如下循环 : 温度 时间 94 30 s 50 30 s 72 1 min 35 个循环 ， 最后 72 延伸 10 min。扩增完成后 ， 取 PCR 产物 5 L ， 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳观察结果 ， 以 DL 2
15、000 Marker 作为参照。 ：弓形虫烯醇化酶 2 基因的克隆与表达 4 2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定 （ 1） 6上样缓冲液的配制：甘油（终浓度 30%） 300 L 、 10%溴酚兰（终浓度 0.25%）25 L、 10%二甲苯氰（终浓度 0.25%） 25 L、 H2O 650 L ，混匀。 （ 2）称取 1.5 g 琼脂糖，加入 100 mL 1 TAE，配制 1.5%凝 胶。 （ 3）微波炉加热 2 min 熔化。 （ 4）室温放置冷却至约 50 左右，加 2 L 溴化乙啶（ 10 g/mL）。 （ 5）倾入胶槽，放置梳子，水平静置约 15 20min。 （ 6）待胶完全凝固后，移
16、入电泳槽，加 1 TAE 到胶面，垂直平稳移去梳子。 （ 7）在 加样孔中 上加 1 L 上样缓冲液（ loading buffer）和 5 L 质粒。混合后加样同时设 阴阳性 对照。 （ 8） 120 V 电压电泳 18 min 左右，根据溴酚兰的位置确定是否继续电泳。 在凝胶成像系统或紫外光暗盒中观察电泳条带。 2.3 克隆载体的构建 2.3.1 PCR 产物的回收 按 TaKaRa 公司的 HQ 1. PCR product of SAG1 gene; 3.2 pMD-ENO2 重组质粒的酶切鉴定 pMD-ENO2 重组质粒 经 EcoR I 和 Hind 双酶切鉴定和 PCR 鉴定，切
17、出约为 1 335 bp的片段，与克隆的目的基因大小相 符，表明成功的构建了 pMD-ENO2 重组质粒。（见图 2） 图 2. PMD-18t-ENO2 酶切鉴定 Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD-ENO2 by digestion with EcoR I +Hind M：分子质量标准； 1. ENO2 基因 PCR 产物； 2.pMD-18T-ENO2 EcoRI 单酶切 ； 3.pMD-18T-ENO2 Hind III 单酶切； 4.pMD-18T-ENO2 EcoR I/Hind III 双酶切； 5.pMD-18T-ENO2 重组质粒 M. DL2000 DNA Marker; 1.PCR product of ENO2 gene; 2. pMD-18T-ENO2 digested with EcoR I 3.pMD-18T-ENO2 digested with Hind ；4.pMD-18T-ENO2 digested with Hind /EcoR I； 5： Recombinant plasmid pMD-18T-ENO2
