1、 绵阳师范学院 本科生毕业论文 题 目 芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究 专 业 化 学 /应用化学 院 部 化学与化学工程学院 学 号 0610410160 姓 名 指 导 教 师 讲 师 答 辩 时 间 二一三 年五月 论文工作时间： 2012 年 12 月 至 2013 年 5 月 论文题目来源： 国家自然科学基金项目 编号： 四川省自然科学研究项目 编号： 校级自然科学研究项目 编号： 绵阳师范学院 2012届本科毕业论文 I 芦丁与牛血清白蛋白的 相互作用研究 学 生 指导教师 摘 要 ： 为了探究黄酮类化合物与蛋白分子的作用方式，本文 用荧光光谱技术研究 了 水溶液中芦丁与牛血清白
2、蛋白的相互作用。结果表明，芦丁 与 牛血清白蛋白 分子在 290 K、 298 K 时结合常数 Ka分别为 4.384103 Lmol-1、 0.7032103 Lmol-1， 根据热力学参数确定其作用力以范德华力或氢键作用力为主。 另外，获得了 芦丁对牛血清白蛋白 在波长 345 nm内源荧光 下 产生较强的荧光猝灭作用， 并根据其 不同温度下猝灭作用 数据参数得出 其 机理为静态猝灭机制 。 关键词 ： 芦丁；牛血清白蛋白；相互作用；荧光光谱 绵阳师范学院 2012届本科毕业论文 II Study on the binding interaction between rutin and B
3、SA Undergraduate Supervisor Abstract： The interaction of rutin and bovine serum albumin (BSA) in aqueous solution (Tris-HCl buffer, pH=7.4) has been studied by fluorescence spectrometry. The results showed that the fluorescence intensity of BSA at 345 nm was quenched intensively by rutin. According
4、to the quenching effect of rutin on the fluorescence intensity of BSA under different temperatures, and the quenching mechanism was confirmed to be a static one. The binding constants Ka at 290 K and 298 K were 4.384103 Lmol-1and 0.7032103 Lmol-1. Based on the thermodynamic parameters, the electrost
5、atic action was confirmed to be Vander walls force or bond. Keywords： Rutin; Bovine serum albumin; Fluorescence spectroscopy 罗 涛 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论 文 1 目 录 前言 /引言 . 1 1 芦丁和牛血清白蛋白的研究现状 . 1 1.1 芦丁 . 1 1.1.1 抗自由基活性 . 1 1.2.2 抗脂质过氧化作用 . 2 1.2.3 血管舒张作用 . 2 1.2.4 抗病毒作用 . 2 1.2.5 拮抗血小板活化因子作用 . 3 1.2.6 抗急性胰
6、腺炎 (AP） . 3 1.2.7 对胃溃疡的保护作用 . 4 1.2 牛血清白蛋白 . 4 1.3 本 研究目的、意义和主要内容 . 4 1.3.1 本 研究的主要内容 . 4 1.3.2 本 研究意义 . 5 1.3.3 创新点 . 5 2 实验原理与理论方法 . 6 2.1 牛血清蛋白检测原理 . 6 2.2 荧光检测原理 . 6 3 实验部 分 . 8 3.1 仪器 . 8 3.2 试剂 . 8 3.3 标准溶液配制 . 8 3.3.1 NaCl 水溶液 . 8 3.3.2 牛血清白蛋白溶液 . 8 3.3.3 Tris-HCl 缓冲溶液配制 . 9 3.3.4 牛血清白蛋白溶液体系的
7、配制 . 9 3.4 荧光测量 . 9 2.4.1 室温（ 290 K）下测量 . 9 罗 涛 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论 文 2 2.4.2 298 K 下测量 . 10 4 结果与讨论 . 11 4.1.1 基础理论 . 11 4.1.2 温度的影响 . 11 4.1.3 药物分子与蛋白质分子间结合力的确定 . 13 5 结论 . 15 参考文献 . 16 致 谢 . 19 罗 涛 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论 文 1 前言 /引言 研究背景 1 芦丁和牛血清白蛋白的研究现状 1.1 芦丁 芦丁 (见图 1-1)又名芸香苷、紫槲皮苷，为一来源很广的黄酮类化合物。主要存在于
8、豆科植物槐的花蕾（槐米）、果实（槐角），芸香科植物芸香全草，金丝桃科植物红旱莲全草及蓼科植物荞麦的籽 苗中 1。 OOO HH OOO HO Hg l u c o s e ( 6 ) r h a m n o s e1 图 1-1 芦丁的结构式图 自发现芦丁化合物以来， 人们对芦丁进行了多种方面的研究，其主要功能表现在如下几个方面： 1.1.1 抗自由基活性 芦丁为黄酮类化合物，是清除自由基的强氧化剂，它可终止自由基的连锁反应，抑制生物膜上多种不饱合脂肪酸的过氧化作用，清除脂质过氧化产物，起到保护生物膜的药理作用 2。姜宝红等 3考察了体外具有较强醛糖还原酶活性的芦丁对大鼠糖尿病肾病（ ND）的
9、防治作用，结论提示芦丁可改善四氧嘧啶大鼠糖尿病肾病，其机制可能与抑制醛糖还原酶和消除氧自由基有关。芦丁在体外具有自由基清除（在10-2 molL-1时的抑制率达到 31.4%）和 抑制醛糖还原酶活性（在 10-2 molL-1时的抑制率达到 74.2%）的作用，从而阻止葡萄糖转变为山梨醇，减弱山梨醇通路激活对大鼠造成的损害。另外，芦丁可降低肾组织脂质过氧化物酶（ LPO）活性，延缓氧罗 涛 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论 文 2 自由基对肌体的进一步损伤。陈仙等 4探讨了芦丁是否对高能冲击波引起的肾功能损伤有保护作用。有学者认为体外冲击波碎石术除产生机械作用外。还可能对肾组织细胞产生生物
10、化学作用，这种作用的基础是氧自由基。氧自由基的产生参与了体外冲击波碎石术后肾功能损害。有资料证实，芦丁具有阻止氧自由基所致的脂质过氧化作用及稳定细 胞膜、抑制细胞膜系统内钙离子水平的异常升高，并通过舒张血管平滑肌而改善肾脏有效血浆流量（ ERPF），增加肾小球滤过率。实验证实在体外冲击波碎石术前应用芸香苷，则体外冲击波碎石术后血丙二醛（ MDA）含量较对照组患者明显降低，血超氧化物歧化酶（ SOD）活性较对照组明显升高，提示芦丁可使氧自由基减少， SOD 活性上升。因此，芦丁通过上述药理作用发挥效应，减轻高能冲击波对肾组织细胞的损害，有效地防治体外冲击波碎石术所致的肾脏损伤。研究表明，脑在缺血
11、低氧时有大量的一氧化氮（ NO）及自由基产生，这可能与脑细胞的凋亡有关， 如对脑缺血损伤有一定的保护作用，其保护作用可能与其抗自由基作用、抗凋亡及减少 NO 生成有关。 1.2.2 抗脂质过氧化作用 脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而引起的一系列氧化过程。朱建林等 5通过对大鼠 SOD 活性、自由基脂质过氧化产物 MDA 含量及大肝脏脂褐（ Lipofuscin）含量的测定及分析发现，芦丁对去势大鼠脂质过氧化有抑制作用，可抑制去势后大鼠抗氧化系统抗氧化能力的下降。芦丁具有对抗内源性雌激素下降引起的抗氧化能力的下降，具有抗氧化作用。高密度脂蛋白（ HDL）具有抗动脉粥样硬化
12、作用。但 HDL 与低密度脂蛋白（ LDL）及极低密度脂蛋白（ VLDL）一样在体外也可被氧化修饰，一旦 HDL 被氧化修饰则具有致动脉粥样硬化作用。孟芳等 6利用体外 Cu2+介导氧化修饰的手段，探讨了芦丁对 HDL 氧化修饰作用的影响。结论表明芦丁可显著抑制 HDL 的氧化修饰。 1.2.3 血管舒张作用 实验检测芦丁对去氧肾上腺素（ phenylephrine， PE）预收缩的胸主动脉环张力的影响，表明芦丁可能通过 NO 鸟苷酸环化酶途径产生内皮依赖性的血管舒张作用7。 1.2.4 抗病毒作用 有研究表明，芦丁有抗 病毒和抑制醛糖还原酶活性的作用。实验发现，芦丁的肺罗 涛 绵阳师范学院
13、2012 届本科毕业论 文 3 指数抑制率 27.1%27.3%，能够降低流感小鼠的肺指数，具有明显的抗流感病毒的作用，并与有关芦丁能够使毛细血管的脆性及异常的通透性得到改善的报道相一致8-9。 1.2.5 拮抗血小板活化因子作用 血栓形成、动脉粥样硬化、炎症反应及缺血再灌注自由基损伤等诸多心脑血管疾病的发病过程均与血小板活化因子（ PAF）介导密切相关，因此拮抗 PAF 的作用，为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径。实验表明，芦丁可拮抗 PAF 与兔血小板膜受体的特异性结合，抑制 PAF 介 导兔血小板黏附与 PMNS 内游离 Ca2+浓度升高，表明芦丁抗 PAF 的作用机制是通过抑制 P
14、AF 受体活化，进而阻断 PAF 诱发的反应，从而起到保护心血管的作用，结果表明芦丁为一种 PAF 受体拮抗药 10。 1.2.6 抗急性胰腺炎 (AP） 芦丁能有效防止低钙血症的发生，并降低胰腺组织 Ca2+浓度。研究发现芦丁能提高胰腺组织大鼠磷脂酶 A2（ PLA2）含量，提示芦丁可能对胰腺组织 PLA2 的释放及激活具有抑制作用；芦丁能有效防止 AP 大鼠低钙血症的发生，可能是通过阻止 Ca2+内流并降低胰腺组织细胞 Ca2+超载，而减轻对 AP 的病理生理损害 11。赵维中等采用放射免疫分析法测定经注射芦丁的模型大鼠血浆血栓素 B2（ TXB2）、前列腺环素（ PG12）及内皮素含量变
15、化。结果芦丁皮下注射给药能有效降低 AP 大鼠血清淀粉酶含量，改善胰腺组织的病理学变化。与 SO 组比较， AP 模型组造模后 12 h血浆的 T/P 比值较 SO 组均显著性升高（ P0.01）；芦丁各用药组的 T/P 比值较 AP模型组显著性降低（ P0.01）。芦丁抗实验性 AP 作用机制可能与降低血浆 T/P 比值，改善胰腺微循环障碍有关。陈爱华等 12观察各组 Wistar 大鼠血液流变学、酶学及胰腺的病理学改变，并对胰腺病理切片进行评分比较。结果 AP 大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞比容、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数均显著升高，病理检查显示胰腺组织明显坏死和炎性细胞浸润。芦
16、丁（ 120、 60、 30 mgkg-1）皮下注射给药，可改善上述各项病理生理指标，结果显示芦丁能有效改善 AP 大鼠血液流变异常，保护胰腺组织。芦丁在产生抗 AP 作用同时，能够降低 AP 大鼠血清异常增高的 NO 水平，提示芦丁的抗 AP 作用机制与其降低 NO 水平有关。研究表明，组织中氧自由基的防御、损害系统的平衡失调乃是其致 AP 组织损伤的原 因。研究显示，芦丁可显著减少 AP 大鼠胰腺组织的 MDA 含量，再次证明了芦丁可以抑制氧罗 涛 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论 文 4 自由基对膜的过氧化作用。同时发现芦丁可提高胰腺组织 SOD 清除氧自由基的活力。提示芦丁一方面通
17、过增强机体对氧自由基的清除能力，另一方面也可通过抑制AP 过程中氧自由基对 膜脂质的过氧化作用，发挥抗 AP 作用 13。 1.2.7 对胃溃疡的保护作用 有报道芦丁对大鼠应激性胃黏膜损伤具有预防性保护作用。王宇翎等在实验中利用大鼠醋酸烧灼型胃溃疡模型，测量大鼠胃溃疡体积及组织病理学检查，并观察芦丁和银杏叶提取液（ GBE）对胃液量、胃酸、胃 蛋白酶活性的影响。芦丁（ 5、 10 mgkg-1）和 GBE（ 25、 50 mgkg-1）造模后给药，可明显减小溃疡体积，组织病理学变化较轻，且对大鼠胃液量，胃液酸度和胃蛋白酶活性无明显影响，显示芦丁对大鼠胃溃疡有明显的治疗作用。 1.2 牛血清白蛋
18、白 牛血清白蛋白是血液的主要成分，称作 BSA，分子量为 68 kD，等电点 4.8，含氮量 16%，含糖量 0.08%，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有 0.2%。白蛋白由 581个氨基酸残基组成，其中 35 个半胱氨酸组成 17 个二硫键，在肽链的第 34 位有一自由巯基。每一个蛋白分子能 携带七个脂肪酸分子。这些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子。血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。尤其是血清蛋白，能够携带着许多药物分子 14，比如芦丁，正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且比较容易地被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、 pH 缓冲作用、载体作用和营养作用 15-17。 1.3 研究目的、意义和主要内容 研究芦丁与牛血清白蛋白作用方式对于开 发应用芦丁类化合物具有重要的学术价值，而当前对于该方面的研究未见报道，因此，本文选取芦丁，采用荧光光谱技术研究其与牛血清白蛋白的相互作用。 1.3.1 研究的主要内容 根据目前芦丁研究的现状，本文采用荧光分析技术，通过牛血清蛋白来进一步
