1、苏州大学本科生毕业设计（论文） 目 录 摘要 . 1 前言 . 3 1 材料和方法 . 3 1.1 材料及主要试剂 . 4 1.2 方法 . 4 1.2.1 引物设计 . 4 1.2.2 PCR 扩增目的片段 . 4 1.2.3 目的片段的分离和回收（ Takara 回收试剂盒） . 5 1.2.4 酶切反应 . 5 1.2.5 连接反应 . 5 1.2.6 感受态细胞制备 . 6 1.2.7 连接产物的转化 . 6 1.2.8 试剂盒抽提质粒 DNA . 6 1.2.9 重组质粒的鉴定 及测序 . 6 1.2.10 原核表达 . 7 1.2.11 SDS-PAGE 蛋白电泳 . 7 2 结果
2、 . 8 2.1 野桑蚕 Serpin-2 基因的 cDNA 序列克隆 . 8 2.2 野桑蚕 Serpin-2 基因的 cDNA 序列分析 . 9 2.3 Serpin-2 重组表达载体酶切鉴定 . 12 2.4 蛋白质表达与 SDS-PAGE 分析 . 13 2.5 Western Bloting 分析 . 错误 !未定义书签。 3 讨论 . 14 参考文献： . 15 致 谢 . 16 附录 1. . 19 附录 2. . 20 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 1 - 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 serpin-2 的克隆、序列分析及表达 摘 要 本研究以家蚕中大造品种为材料，以其 c
3、DNA 为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂 Serpin-2 基因；采用大肠杆菌原核表达系统（ BL21）进行家蚕 Serpin-2 基因的表达研究。主要结果如下： 根据 已知野蚕 Serpin-2（ GenBank 登录号 ： AF242200.1） 序列设计 合适的引物，采用 PCR 方法克隆了家蚕 Serpin-2 基因。序列分析表明，家蚕 Serpin-2 基因编码区长度为 990bp，编码 329 个氨基酸，相对分子量约为 43.75 kDa，等电点约为 4.67。与家蚕Serpin-2 比较发现，两者基因序列相似度高达 99.29%，氨基酸序列相似度高达 98.93%，推测家蚕 S
4、erpin-2 与野桑蚕 Serpin-2 基因起着相同或类似的作用。 将家蚕大造 Serpin-2 基因克隆进原核表达载体 pET-28a(+)，转化到大肠杆菌 BL21中，经 1 mmol/L IPTG 诱导蛋白质表达。 SDS-PAGE 电泳分析结果表明，经 IPTG 诱导转化家蚕 Serpin-2 的 BL21 菌与对照 BL21 菌、空 pET-28a(+)转化 BL21 菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带，相对分子量约 44 kDa，与预计的大小相符，证实家蚕Serpin-2 在大肠杆菌中得到表达。 家蚕 Serpin-2 基因的成功克隆和原核表达研究为 从分子水平上解析 Serp
5、in 在野桑蚕体内的功能打下了基础。 关键词 ：家蚕； Serpin-2；基因克隆；原核表达 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 2 - Cloning and prokaryotic expression of Serpin-2 gene of Bombyx mori Abstract In this study， the gene of Serpin in Bombyx mori (Serpin-2) was cloned by PCR using the whole body cDNAs as templates. E.coli prokaryotic expression system
6、 was used for expression study of serpin-2 gene. The main results are as follows: According to the sequence of Bombyx mandarina serpin-2 gene, proper primer was designed and Serpin-2 gene of Bombyx mori（ The GenBank accession numbers： AF242200.1） was cloned by PCR. According to sequence analysis, th
7、e 990bp coding region of Serpin-2 encoding 329 amino acid residues results in theoretical molecular weight of 43.75 kDa, isoelectric point of 4.67. Comparied to the Serpin-2 gene of Bombyx mori and Bombyx mandarina， the gene identity and amino acid identity reach 98.7%， respectively. It reveals that
8、 Serpin-2 of Bombyx mori and Bombyx mandarina may play a same or similar role. The Serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector pET-28a（ +） and then transformed into E. coli BL21(DE3). And 1mmol/L IPTG was used to induce the target protein to express. SDS-PAGE analysis indicate
9、d that there was a specific band with relative molecular weight of 44 kDa on PAGE profiles for the BL21 with Serpin-2 induced by IPTG, comparied to the contract BL21 and BL21 with empty pET-28a(+)， which confirmed that the Serpin-2 gene was successfully expressed. The successful cloning and prokaryo
10、tic expressing research of Serpin-2 gene in Bombyx mori has established the foundation for analying the fuction of Serpin in Bombyx mori. Key words: Bombyx mandarina; Serpin-2; cloning; prokaryotic expression 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 3 - 前 言 丝氨酸蛋白酶抑制剂（ Serine protease inhibitor, Serpin）是一族由古代抑制剂趋异进化 5 亿年衍变
11、而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂 ，是一种 球状蛋白 ， 并且各种 Serpins大约有 30 的序列同源性，疏水区同源性高达 70 2。 目前，大约已有 500 种 Serpins 在动物、微生物、病毒和植物中得到鉴定 （ Irving JA， et al.， 2000） 。 由 350 至 500 个氨基酸组成并且有着高度保守的三级结构 3。该抑制剂已陆续在 真核生物，细菌和病毒中得到 鉴定 ，而其超家族很多成员也被鉴定存 在 于 病毒、植物和动物细胞组织中， 而这些成员中大多数都是从哺乳动物血浆中分离的，它们大多与凝血过程有关 4。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶
12、的活性而参与了许多基本的生命活动 3，已经被广泛应用 于 农业 、 医 药 和食品等行业 ，对昆虫的生命活动也至关重要。 Serpin 在昆虫的头部、精巢和卵巢中的含量也很丰富， 甚至在丝腺，中肠中也有分布，并且在受到外界微生物刺激时 Serpin 在昆虫的血淋巴和脂肪体中大量表达 （ Tong Y and Kanost MR， 2005； Aratake H， et al.， 1990； Zou and Jiang， 2005） 。有报道证明，一些 Serpins 在血细胞的细胞质中表达，也有一些 Serpins 蛋白在细胞内产生作用，定位于细胞质或细胞质和细胞核之中 （ Tong Y an
13、d Kanost MR， 2005； 樊净 ， 2003） 。 近 10年来，昆虫 Serpin 分子水平的研究进展很快，但 与哺乳动物相比，其新基因的发现、基因结构分析、表达调控和基因功能的研究较少，对于有些基因的功能机制还不清楚，在鳞翅目野桑蚕中的研究则更少 6。 目前对家蚕 serpin家族成员的研究主要集中在 Serpin6（刘衬丽，许雅香等）、 Serpin16（董照明，赵萍等）和 Serpin4（查宏贤，许雅香等）。其中对 Serpin2的研究主要在烟草天蛾， Tong和 Kanost（ 2002）发现烟草天蛾 serpin2A参与免疫反应，抑制多种血淋巴蛋白酶，如烟草天蛾 Ser
14、pin2抑制了血液中酚氧化酶原的活化级联反应；使用革兰氏 阴性菌和阳性菌刺激烟草天蛾后， Serpin2与血液中的 HP1形成复合物；并且， Serpin2还同时与 HP21以及另外两个未鉴定的蛋白酶形成复合物。 Zou等（ 2009）将家蚕 34条 serpin进行了进化分析，发现家蚕 Serpin2与烟草天蛾的 Serpin2A有较高同源性。 为此本课题拟对家蚕 Serpin2基因 作较详细有研究，主要集中在基因克隆，序列分析 比对。 为研究家蚕 Serpin2蛋白的功能打下基础。本研究计划利用基因 Bank获得了 野桑蚕 丝氨酸蛋白酶抑制剂（ Serpin2）基因序列、 通 过已知序列
15、设计引物。利用 PCR技术基因克隆技术扩增并克隆家蚕 Serpin2基因。经基因测序，对序列进行分析和比对。从而达到研究目的。 1.材料和方法 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 4 - 1.1 材料 及主要试剂 家蚕（大造） cDNA、 宿主菌 E coli TG1 菌种、 BL21 菌 皆为苏州大学特种经济动物饲养实验室保存。 克隆载体 pUCm-T 为 Takara 公司产品；原核表达载体 pET-28a（ +） 由本实验室保存。 PCR 试剂盒 （内含 Taq 酶、 dNTPmix、 10buffer 等） 、 凝胶回收试剂盒、 250 bp DNA Marker、 100bp-600
16、0bp DNA Ladder Marker、 限制性内切酶 Hind3、 BamH1和 T4 DNA Ligase 为宝生物工程 (大连 )有限公司产品 ；蛋白质 Marker 为 Promega 公司产品；小牛血清白蛋白为上海生工生物工程有限公司产品；质粒小量快速抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品。 NCBI 的 Blast 工具； ExPASy 在线 ScanProsite 程序（ http:/www.expasy. org/tools/pi_tool.html ）； http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 在 线 程 序 ；DNAMAN 软件
17、 ； Tanon Gis 凝胶图像处理系统。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 根据家蚕 Serpin-2序列设计一对引物扩增野桑蚕 Serpin-2基因的 ORF区域。 正向引物 SPN2F： 5-CCCAAGCTTTCAATTTCGTCCACG-3 反向引物 SPN2R： 5-CGCGGATCCATGGATTCAAAGGCT-3 1.2.2 PCR扩增目的片段 a. 在离心管中，按照 Takara 公司 Taq 酶的使用说明进行如下操作： ddH2O 35.5 L 10LA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 5 L dNTP 混合物 (每种 10 mmol/L) 4 L
18、 Serpin2F 2 L (10 mol/L) Serpin2R 2 L (10 mol/L) 模板 cDNA 1 L（约 0.1 0.2 g） LaTaq 酶 0.5 L 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 5 - Total volumn： 50L b.将含上述混合物的反应管放入 PCR 仪中， PCR 反应体系的条件如下： 94 预变性 2 min 94 变性 30 sec 48 复性 30 sec 33 cycles 72 延伸 1.5 min 72 延伸 10 min c. PCR 反应完成后，取 5 L 电泳鉴定。 1.2.3 目的片段的分离和回收（ Takara回收试剂盒） （
19、 1） 从电泳 板上切割含目的 DNA片段的凝胶块 。 （ 2） 将 胶块 放入 1.5 ml管中 ， 将其适当切小 ， 加速溶解 。 加入 200 l 胶块融化液 DR-I Buffer。 （ 3） 均匀混合后 75 加热融化胶块。此时应间断振荡，使胶块充分融化。 （ 4） 向上述胶块融化液中 加入 DR-II Buffer100 l（ 1/2 DR-I Buffer量），均匀混合。 （ 5） 将试剂盒中的 Spin Column安置于 Collection Tube上。 （ 6） 将上述混合液转移至 Spin Column中， 12 000 r/min离心 1 min，弃滤液。 （ 5）
20、将 300 l Rinse A加入 Spin Column中， 12 000 r/min离心 30s，弃 废液 。 （ 6） 将 500 l Rinse B加入 Spin Column中， 12 000 r/min离心 30s，弃 废液 。 （ 7） 重复步骤 （ 6） 。 （ 8） 将 Spin Column安置于新的 1.5ml的离心管上，在 Spin Column膜中央处加入 25ul 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置 1min。 （ 9） 12 000 r/min离心 1 min洗脱 DNA。 1.2.4 酶切反应 在 500 L 的微离心管中依次加入 ddH2O
21、 8 L， 10K buffer 2 L ，质粒 8L，限制性内切酶各 1 L，组成 20 L 酶切体系， 37 水浴反应 2 h，取酶切产物 8 10 L进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，检测是否酶切完全，并拍照记录。 1.2.5 连 接反应 与 pUCm-T 载体连接（ 10L）： 在微离心管中依次加入 PCR 纯化产物 7.5 L， 载苏州大学本科生毕业设计（论文） - 6 - 体 pUCm-T 0.5 L， T4 DNA Ligase buffer 1L， T4 DNA Ligase 1L； 16 水浴反应 12 h。 1.2.6 感受态细胞制备 用无菌铂丝直接醮取 E coli TG1
22、菌株，在 LB 平板表面划线 ， 37 倒置培养过夜；从 LB 平板上挑取单菌落，接种于 3 mL LB 液体培养基中， 37 震荡培养过夜；取 30 L培养液接种于 3mL LB 液体培养基， 37 震荡培养 2.5 h， 至肉眼能看到微微浑浊；将培养液转入 1.5ml Eppendorf 管，冰浴 10 min； 4、 4 000 r/min5 min，弃上清；用预冷的 75mmol/L CaCl2 750L 轻轻悬浮细胞，冰浴 30 min； 4、 4 000 r/min4min，弃上清；加入预冷的 75 mmol/L CaCl2 （内含甘油终浓度为 15） 200 L，轻轻悬浮，冰浴至
23、少 4 h，即成感受态细胞悬液，分装后 -70 保存。 1.2.7 连接产物的转化 取 200 L 感受态细胞悬液，加入连接溶液 10 L，轻轻混匀， 冰上放置 30 min；42 水浴 1.5 min，冰上放置 2.5 min， 加 入 1 mL 37 预热的液体培养基， 37 预表达 1 h，使细胞恢复正常生长状态； 4， 3500 r/min5 min，将菌液浓缩至 200 L，分别加入 10 L 的 IPTG 和 20L X-gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含 Amp+的 LB 固体培养基上， 37 正面放置 30 min，待菌液完全被培养基吸收后， 37 倒置培养过夜。 1.2
24、.8 试剂盒抽提质粒 DNA 挑取转化后的白色单菌落，分别接种于 3 mL 含适当 Amp+抗生素的 LB 培养基，37 下 200 r/min 振荡培养过夜。 之后按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行 DNA抽提。 1.2%琼脂糖凝胶电泳至质粒条带迁移至凝胶中部以后，仔细分辨迁移率的差异，选取迁移率较小的几管质粒 DNA 用于进一步鉴定。 1.2.9 重组质粒的鉴定及测序 取上述迁移率较小的几管质粒 DNA 用酶切进行鉴定；取适量的酶切或 PCR 产物进行 1.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 ; 取电泳结果符合预期的样品送公司测序 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 7 - 1.2.10 原核表
25、达 如图 1，构建 pET-28a(+)-Serpin-2原核表达质粒。 挑取转 化有重组原核表达质粒的大肠杆菌 BL21 单菌落，在含卡那霉素的 3 mL LB液体培养基中 37， 200 rpm 振荡培养过夜；取 30 L 过夜培养菌于含有卡那霉素的 3 mL LB 液体培养基中继续振荡培养；当 OD600 值约 0.6 时，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L， 37 ， 200 r/min 振 荡培养 6 h。取 1.5 mL 培养液于离心管中， 10 000 g 离心 5 min，弃上清；加入 100 L TE buffer（ pH 8.0） ，悬浮菌液沉淀，加入 100 L
26、的2样品缓冲液，煮沸 5 min，即可上样。 图 1 Serpin-2 基因原核表达载体的构建 1.2.11 SDS-PAGE蛋白电泳 Lac 1 ori Kan+ BamH Hind pET-28a(+) Lac 1 ori Kan+ BamH Hind pET-28a(+) 重组质粒 BamH Hind Kan+ ori Lac 1 pET-28a(+)- Serpin-2 BamH Hind Serpin-2 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 8 - 安装好电泳槽，按表 1 配制 4 mL 12%分离胶。迅速在两玻璃板间灌注分离胶，加一层去离子水。将凝胶垂直静置于室温 30 min。弃
27、去分离胶上层去离子水，按表 1 制备 2.5 mL 5%的浓缩胶，将配置好的浓缩胶快速灌注在两玻璃板上部，并在上面插入梳子，小心操作避免混入气泡；室温聚合 30 min，小心拔出梳子，在电泳槽中加入 10Tris 甘氨酸电泳缓冲液，用注射器取 10 L BL21 菌液 、空载质粒 BL21 菌液、表达样品上样， 80V电泳；待溴酚蓝从浓缩胶进入分离胶界面时，将电压调至 100V；待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳；凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色 10 min，弃染色液加脱色液脱色 10min，弃脱色液后再次加脱色液在摇床上低速摇动 12 h，直至背景清晰；最后拍照记录。 表 1 SDS-PAGE
28、 电泳的凝胶配制 （ 单位为 mL） 1 2 3 4 5 6 7 8 胶类型 胶浓度 去离子水 Cry/Bis Buffer Buffer APS TEMED (30 ) (pH8.8) (pH6.6) (10 ) (10 ) 浓缩胶 5 1.02 0.43 - 1.0 0.05 0.002 分离胶 12 1.125 1.6 1.25 - 0.025 0.002 注 ： APS需现配现用， 0.1g过硫酸铵 +1ml H2O。 2 实验 结果 2.1 家蚕 Serpin-2基因的 cDNA序列克隆 以 野桑蚕 cDNA 为模板，利用引物 SPN2F 和 SPN2R 进行 PCR 扩增反应，得到
29、大约 1100 bp 的条带 (图 2)。将 目的条带连接 T 载体，利用原核克隆体系富集重组质粒后进行酶切验证。 (图 3) 图 2 家 蚕 Serpin-2 编码区克隆 M:250 bp 分子量标准 ; 1: Serpin-2 编码区克隆 苏州大学本科生毕业设计（论文） - 9 - 图 3 Serpin-2 编码区克隆重组质粒酶切鉴定 M: 6000 bpDNA Ladder Maker; 1: Hind3 、 BamH1 双酶切的重组质粒 2.2 野桑蚕 Serpin-2 基因的 cDNA 序列 分析 通过软件得到 家蚕 与野桑蚕 Serpin-2 基因序列相似性直观分析图（图 4）。 图中重合部分为相似部分，从图中可知两者相似度极高。 图 4 家蚕与野蚕的相似性分析 为了进一步研究二者的相似性，本研究通过 blast方法 在 genbank网站中进行两基因对
