1、硼替佐米对伯基特淋巴瘤 Raji 的体外治疗作用李靖 1，闫明明 21.河南省洛阳职业技术学院，河南洛阳，4710022.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳，471002摘要：【目的】探究硼替佐米对伯基特淋巴瘤 Raji 细胞体外治疗作用及其可能机制。【方法】MTT 实验检测硼替佐米对淋巴瘤 Raji 细胞活力的影响；Western blotting 实验和 RT-PCR 实验检测硼替佐米对 Raji 细胞中 NF-B p65 表达和 Caspase-3 剪切的影响。【结果】MTT 实验表明硼替佐米抑制 Raji 细胞活力，并且其抑制作用呈剂量、时间依赖性（P0.05）；Western blo
2、tting 实验和 RT-PCR 实验显示硼替佐米显著抑制 Raji 细胞 NF-B p65 表达并且促进 caspase-3 的剪切（P0.05）。【结论】硼替佐米能够抑制 Raji 细胞增殖，机制可能与抑制 NF-B（P65）激活和上调 cleaved-caspase-3 表达有关。【关键词】硼替佐米；淋巴瘤；NF-B The therapeutic effect of Burkitt bortezomib on lymphoma Raji in vitroLi Jing1, Yan Ming-ming21:Luoyang Vocational College of Technology,
3、 Luoyang 471002,China2:First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471002,ChinaAbstract: Objective: To explore therapeutic effect of bortezomib on Burkitt lymphoma and its possible mechanism. Methods: The effect of bortezomib on human lymphoma Raji cells prolifer
4、ation was determined by MTT assay. The expression of NF-B p65 and Cleaved-caspase-3 protein were detected by Western blotting. NF-B p65 and Cleaved-caspase-3 mRNA expression were detected by RT-PCR. Results: The data showed that bortezomib inhibited Raji cells proliferation and the inhibition rate w
5、ere related in a dose-dependent manner and a time-dependent manner (P0.05). Western blotting data indicated that the expression of NF-B p65 was decreased and the expression of Cleaved-caspase-3 was increased after bortezomib treatment in a dose dependent manner (P0.05). RT-PCR data demonstrated that
6、 the mRNA expression of NF-B p65 was decreased and the mRNA expression of Cleaved-caspase-3 was increased after bortezomib treatment in a dose dependent manner (P0.05). Conclusions: Bortezomib can inhibit Raji cells proliferation may via downregulating the expression of NF-B and upregulating the exp
7、ression of Cleaved-caspase-3.Key words: Bortezomib; lymphoma; NF-B伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)，属于 B 淋巴细胞性的非霍奇金淋巴瘤（NHL），常发于儿童和青少年，很少在中年人群中发现 1。70%-80%高速增殖的 BL 发生染色体易位 2，染色体易位导致致癌基因和 c-Myc 基因过表达以及组成性激活，导致细胞形状转化，细胞增殖失控 3。目前，BL 化疗包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、阿糖胞苷和利妥昔单抗针对性治疗，虽然在儿童患者取得了一定的治疗效果，然而对青少年患者来说依然存在预后较差现象 4,
8、5。因此需要有更有效的化疗药物提高淋巴瘤的治疗效果。异常 NF-B 激活以及促增殖和抗凋亡基因的高表达，是多种恶性淋巴瘤主要特征之一，如霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤，弥漫性大 B 细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。有研究证实，NF-B 参与调控 B、T 淋巴瘤细胞增殖基因 cyclin D1 和 c-Myc 和抗凋亡基因(Bcl-2, Bcl-xL)激活 6，且与淋巴细胞发生、发展和增殖相关 7。另外，c-Myc 可以通过 NF-B 信号途径抑制免疫系统导致伯基特淋巴瘤免疫缺陷 8。这些研究暗示以 NF-B 为靶标的药物可能用于治疗伯基特淋巴瘤。硼替佐米（Bortezomib，BZ）是 FDA第一个批
9、准的蛋白酶体抑制剂，可以通过抑制IB降解，进而抑制转录因子 NF-B的激活和转位 9，可以用于套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗 10。然而硼替佐米治疗伯基特淋巴瘤的作用和机制尚未完全了解 11。因此，我们研究了硼替佐米对人淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖的影响及其可能的机制。1 实验内容1.1 主要试剂人淋巴瘤细胞株Raji细胞购自American Type Culture Collection，RPMI-1640 培养基购自美国Sigma公司，胎牛血清（FBS）购自美国Invitrogen公司，NF-B p65抗体、Cleaved-caspase-3抗体和GAPDH抗体均购自美国Santa C
10、ruze公司，抗兔和抗鼠二抗购自江苏碧云天生物研究所。1.2 引物NF-B p65、cleaved-caspase-3和GAPDH引物由上海生工生物公司合成，NF-B p65引物序列：forward：5-GTTCACAGACCTGGCATCCGT-3，reverse：5- GAGAAGTCCATGTCCGCAATG-3； Cleaved-caspase-3引物序列：forward ：5- GTTTGAGGACCTTCGACCAG-3，reverse：5- CAAAGATGTCGTCCAGGGTC-3； GAPDH引物序列：forward ：5- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，r
11、everse：5- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。1.3 细胞培养人淋巴瘤细胞株Raji细胞培养于37、含有5%CO 2饱和湿度培养箱中，其培养基是含有10%FBS的RPMI-1640培养基，并且向培养基加入青霉素- 链霉素双抗。分别向Raji 细胞培养基中加入生理盐水溶解的硼替佐米，硼替佐米最终浓度分别为0、5、10、20和50 nmol/L（nM）1.4 方法1.4.1 MTT方法检测Raji细胞株活力将Raji细胞接种到96孔板中，每孔接种110 4个Raji细胞，在37、含有5%CO 2饱和湿度培养箱中培养24 h后，分两组实验。一组与不同浓度硼替佐米（0、5、10、2
12、0和50 nM）共同孵育24 h，每个浓度设置4个复孔；另外一组是用10 nM硼替佐米与Raji细胞分别孵育24 h、48 h和72 h，每个时间点设置4个复孔。之后每个组加入20 l MTT工作液，在培养箱内继续培养4 h，吸出培养基，加入200 l DMSO，摇床摇晃10 min充分溶解结晶物。将96孔板盖打开，放入酶标仪检测，在波长490 nm 处检测OD 值，并做记录。，以上实验重复3次。1.4.2 Western blotting实验按照实验要求用不同浓度硼替佐米（0、5、10、20和50 nM）处理Raji细胞24 h后，PBS洗涤细胞，加入细胞裂解液RIPA（其中含有蛋白酶抑制剂
13、 1:1000），冰上裂解30 min，收集蛋白。离心（4， 12000g/min）15 min。BCA 蛋白定量试剂盒定量后调整各组蛋白上样总量至30 g。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转到PVDF上。室温5% 牛奶封闭1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入NF-B p65抗体(1:2000稀释)、Cleaved-caspase-3抗体(1:1000稀释)和GAPDH抗体(1:5000稀释)4 下孵育过夜。 TBST洗膜3次，每次5 min。孵育相应的二抗(1:1000稀释)，TBST洗膜3次，每次10 min。加ECL发光液显影，用自动显影仪显影，并分析条带灰度。用自带软件
14、扫描灰度值。1.4.3 RT-PCR检测按Invitrogen公司试剂盒说明书从Raji 细胞提取总RNA，酶标仪测定样品在260 nm和280nm处吸光度(OD) ，并进行核酸定量。每个反应管加总 RNA 2 g，总反应体系20 l，反应条件：42， 20 min；99，5 min；4 ，5 min。PCR扩增体系：10反应缓冲液 10 l，cDNA 20 l，forward引物1 l，reverse引物1 l，Taq酶1 l，ddH 2O2 7 l。扩增条件:94，60s；60 （(NF-B p65）58（Cleaved-caspase-3），30s；72，60s；进行32个循环。然后72
15、，10 min，4 保存。取上述扩增产物10 l， 1.5%凝胶电泳在100V电压下电泳1 h。凝胶成像系统显影并扫描灰度值。1.5 统计分析所有实验数据采用SPSS20.0进行统计学分析。实验结果以均数标准差（meanSD）表示，多组数据采用单因素方差分析（ANOVA），并用Bonferroni法进行均数组间的两两比较，以P0.05表示差异有统计学显著性。2 结果2.1 MTT实验检测Raji细胞活性MTT实验结果显示，不同浓度硼替佐米对Raji细胞有显著抑制作用（P0.05），同一浓度不同时间对Raji细胞也有显著抑制作用（P0.05）。见图 1.图1 MTT实验检测硼替佐米对 Raji细
16、胞活性影响。A 不同浓度硼替佐米与Raji细胞孵育24 h后，通过MTT实验检测其活力（n=3，*P0.05）。B 10 nM硼替佐米与Raji细胞孵育不同时间后，通过MTT实验检测其活力（n=3，*P0.05）。2.2 Western blotting实验分析目的蛋白Western blotting 实验结果表明随着硼替佐米浓度增加，NF-B p65 表达减少，Cleaved-caspase-3 表达增加（ P0.05）。见图 2.图 2 Western blotting 实验分析目的蛋白。（n=3 ，*P 0.05 vs 0 nM）。2.3 RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中NFB
17、p65和Caspase-3 mRNA的影响。RT-PCR检测结果表明在硼替佐米抑制Raji细胞增殖时，伴随着NF-B p65 mRNA下调以及Cleaved-caspase-3 mRNA上调，并且呈剂量依赖性（ P0.05）。见图3.图3 RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中NF-B p65和 Cleaved-caspase-3 mRNA的影响（n=3，*P 0.05 vs 0 nM）。3 讨论传统化疗占据肿瘤疾病治疗的中流砥柱，但很多化疗药物对肿瘤治疗效果并不尽人意，且还经常发生毒副作用和耐药性，从而妨碍药物的临床使用。蛋白酶体是多蛋白复合物，对泛素降解起着重要的作用 12。有报道论述，
18、蛋白酶体活性异常会增加内质网压力，最终引起肿瘤细胞凋亡 13。因此，抑制蛋白酶体活性已经成为研究肿瘤治疗新的方向 14。硼替佐米是二肽硼酸蛋白酶体抑制剂，具有干扰DNA修复、诱导细胞凋亡的作用。本研究发现硼替佐米对Raji细胞活力有显著抑制作用，并且具有浓度和时间依赖性。进一步，研究发现，硼替佐米能够下调Raji细胞中NF-B蛋白和mRNA表达，上调Cleaved-caspase-3 蛋白和 mRNA表达，均具有浓度依赖性。NF-B 是转录因子蛋白家族，参与调控机体免疫应答、炎症反应甚至肿瘤发生进展等多种生命进程。而NF-B异常转位，会导致调控失衡。众多研究发现，在肿瘤细胞凋亡时，NF-B转录
19、受到抑制 3,15。本研究初步表明，硼替佐米可能通过抑制IB降解，进而抑制转录因子 NF-B的激活和转位，最终促使caspase-3剪切，最终抑制 Raji细胞增殖，从而起到治疗淋巴瘤作用。参考文献1 Israels T, van de Wetering M D, Hesseling P, et al. Malnutrition and neutropenia in children treated for Burkitt lymphoma in MalawiJ. Pediatr Blood Cancer,2009, 53(1): 47-52.2 Dang C V, ODonnell K A,
20、 Juopperi T. The great MYC escape in tumorigenesisJ. Cancer Cell, 2005, 8(3): 177-178.3 孙晓非 , 甄子俊, 刘冬耕, 等. 改良B-NHL-BFM-90方案治疗儿童青少年伯基特淋巴瘤的疗效分析J. 癌症 , 2007,26(12): 1339-1343.4 林宁晶 , 郑文, 张运涛,等 . 13例伯基特和伯基特样淋巴瘤的临床特点分析J. 中国肿瘤临床, 2010,37(1): 5-8.5 杨艳. 弥漫性大B 细胞淋巴瘤中hENT1、NF-B的表达及意义 D. 安徽医科大学, 2013.6 李百周, 叶洪
21、涛, 周晓燕. CARMA1-BCL10-MALT1,NF-B信号传导通路与淋巴瘤J. 中国癌症杂志,2007,17(9): 733-739.7 Tafuku S, Matsuda T, Kawakami H, et al. Potential mechanism of resistance to TRAIL-induced apoptosis in Burkitts lymphomaJ. Eur J Haematol,2006, 76(1): 64-74.8 李颖璐. 硼替佐米治疗滤泡性淋巴瘤疗效及不良反应的分析J. 中国实验血液学杂志,2015,23(1): 119-122.9 倪晓光,
22、赵平. 泛素-蛋白酶体途径的组成和功能 J. 生理科学进展, 2006,37(3): 255-258.10 陈玉清, 周东 , 时杰,等. 硼替佐米治疗难治复发非霍奇金淋巴瘤的临床观察J. 临床医学, 2012,32(6): 9-11.11 Shah J J, Orlowski R Z. Proteasome inhibitors in the treatment of multiple myelomaJ. Leukemia,2009, 23(11): 1964-1979.12 Ye Y. The role of the ubiquitin-proteasome system in ER qu
23、ality controlJ. Essays Biochem, 2005, 41: 99-112.13 李明 , 缪泽鸿, 丁健. 蛋白酶体及其抑制剂的研究进展 J. 中国药理学通报, 2008,24(5): 565-569.14 杨小刚, 李晓林, 陈懿建 , 等. 硼替佐米诱导Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡的研究J. 中国实验血液学杂志, 2009,17(3): 592-596.15Li Y, Lin Z, Chen B, et al.Ezrin/NF-kB activation regulates epithelial- mesenchymal transition induced by EGF and promotes metastasis of colorectal cancerJ.Biomed Pharmacother, 2017,92:140-148.
