1、油茶籽水酶法制油水相固形物中茶皂素含量测定研究郭咪咪 薛雅琳 1 张东 段章群 王雅朦 朱琳 李秀娟 李晓宁（国家粮食局科学研究院 油脂化学研究组 北京 100037）摘 要 本研究建立了一种液相色谱测定茶皂素含量的方法。色谱柱 SUPELCOTM LC-18（4.6 mm*250 mm，5 m）；流动相为甲醇 -0.1%磷酸（体积比 40:60）；流速 0.8 mL/min；检测波长 267 nm；柱温 30。该方法平均加标回收率 90.88%113.13%，精密度达 0.19%，定量检出限 0.67%，测得水相固形物中茶皂素质量分数为 54%，与比色法测定结果相接近，但液相法具有测定简便、
2、快速、准确等特点；与相关液相测定茶皂素方法报道相比，该方法色谱峰分离较好，且避开了溶剂峰干扰等特点，适合作为测定茶皂素含量的分析方法。关键词 水相固形物 茶皂素 含量 液相色谱中图分类号：TS2 文献标志：A 文章编号： Quantitative Analysis of Saponin From Water phase solids produced in Camellia oil aqueous enzymatic extraction process Guo Mimi, Xue Yalin, Zhang Dong, Duan Zhangqun, Wang Yameng, Zhu Lin,
3、Li Xiujuan, Li Xiaoning(Oil and Fat Chemistry Research Group, Academy of State Administration of Grain , Beijing 100037)Abstract A liquid chromatographic determination method of saponin content was established in this article. This method average recovery rate of saponin was 90.88%113.13%, the degre
4、e of precision was 0.19%, the quantitative detection limit was 0.67%, and the mass fraction of saponin from water phase solids was about 54%, when the determination conditions were as follows: SUPELCOTM LC-18 (4.6 mm*250 mm, 5 m), mobile phase methanol-0.1% phosphoric acid solution ( volume ratio 40
5、:60 ), flow rate 0.8 mL/min, detecting wavelength 267 nm, column temperature 30. Although the liquid chromatographic method result of saponin content was similar to the spectrophotometric method, this method was simplicity, quickness and accuracy. And this liquid chromatographic method had a better
6、separation effect on chromatograph peaks, and could avoid the solvent peak interference, when compared with the relevant report on liquid chromatographic method of saponin content. It was a suitable analyzes method for determination of saponin content.Key words water phase solids, saponin, content,
7、liquid chromatographic中国是世界上油茶分布最广的国家，主要分布在我国南部地区，同时也是油茶籽油生产基地最大的国家，年产量 15 万 t 左右。油茶籽中含油量（干基）39.6%65.3% ，提取油茶籽油是合理利用油茶籽的有效途径之一。酶法生物提油（水酶法）是近年来研究较多的一种新型提油工艺，在油茶项目基金：公益性行业（粮食）科研专项：油茶籽加工链质量保障与提升关键技术研发（201513003-7）收稿日期：2017-11-23作者简介：郭咪咪，女，1987 年出生，硕士，粮食、油脂与植物蛋白工程1通信作者：薛雅琳，女，1960 年出生，教授级高级工程师，分析化学 籽提油中得
8、到广泛应用，其特点在于能耗小、反应条件温和且可以有效保护油脂、蛋白、胶质等可利用成分的品质。水酶法提取的油茶籽油，虽然油中保留了较多的营养成分，但加工过程中副产物水相富集了茶皂素、多糖、蛋白质等物质 1，有研究报道 2，水酶法油茶籽油工艺水中茶皂素质量分数 5.98%、多糖 6.14%、蛋白质 5.12%、总黄酮 0.047%。直接将水相排放不仅造成资源浪费，还导致水体环境 COD 超标等问题。如何合理利用副产物？如何解决环境问题？已成为加工企业生产加工链中首要考虑的问题。目前油茶籽在加工副产物中提取分离具有高附加值的茶皂素、多糖等方面有相关研究报道 3,4,5,6，这不仅增加了副产物利用率、
9、提升油茶籽的使用价值和经济价值，还为油茶籽精深加工、形成产业链等奠定基础。油茶皂素是皂素中的一类，主要存在于油茶籽仁和壳中，基本结构包括配基、糖体和有机酸，属于五环三萜类皂苷的混合物。目前国内外 7,8对茶皂素的研究主要在提取纯化、含量测定和少部分的结构鉴定等方面，但目前对于油茶籽水酶法水相固形物中成分研究分析较少。本研究以水相固形物中茶皂素为研究对象，建立一种快速、稳定、准确测定茶皂素含量的液相方法。不仅为充分利用茶皂素资源提供数据参考，还可为更快、更有效的监控水酶法排放液中茶皂素提供技术支持。因此建立适合水相中茶皂素含量快速分析的方法，对水酶法工艺产业链发展是非常重要的。1 材料与方法1.
10、1 材料与试剂水相固形物（自制：由油茶籽水酶法提油的水相液体喷雾干燥得到的粉末固体物质）；茶皂素标准品（规格 99%）：陕西帕尼尔生物科技公司；浓硫酸（分析纯）；香草醛；甲醇（色谱纯）等。1.2 仪器与设备分析天平（0.0001g）；TU-1810 紫外可见分光光度计；1100 型高效液相色谱仪（配置紫外检测器）等。1.3 试验方法 1.3.1 茶皂素含量比色法测定茶皂素标准溶液的配制：精密称取茶皂素标准品 10.8 mg，水溶解，10 mL 容量瓶中定容，得1.08 mg/mL 的茶皂素标准溶液备用。标准曲线制作：准确移取标准溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL 分别于 10
11、mL 具塞试管中，依次加入蒸馏水 0.8、0.7、0.6、0.5、0.3 mL，在冰水浴条件下精确加入 8%香草醛乙醇溶液 0.5 mL，反应 510 min，然后加入 77%硫酸溶液 4 mL，摇匀，置于 60 水浴中加热 15 min 后，取出置于冰水浴中冷却约 10 min，取出静置至室温。同时做空白样品对照。取 0.5 mL 标准溶液的显色反应液于 1 cm 比色皿中，紫外 -可见分光光度计全波长扫描，得出最大吸收波长，在最大吸收波长下测定各茶皂素标准工作液吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。样品制备：称取水相固形物粉末 6.0 mg 左右，蒸馏水溶解，1
12、0 mL 容量瓶定容，取 1 mL 于 10 mL 具塞试管，显色反应处理方法同标准曲线测定相同，测定其吸光度。油茶皂素含量以质量分数表示，计算公式如下： 10/%油mc质 量 分 数式中：c-表示从标准曲线中计算得到的油茶皂素浓度（ mg/mL）；m -表示称量的样品质量（mg）。1.3.2 茶皂素含量液相色谱法测定茶皂素标准工作液的制备：准确称取 10.0 mg 茶皂素标准品，80%甲醇溶解并定溶于 10 mL 容量瓶中，即得 1 mg/mL 的茶皂素甲醇标准溶液。用 40%甲醇溶液稀释，依次得到0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL 的标准工作液，0.45 m 微孔滤膜过
13、滤，液相色谱分析。样品制备：准确称取水相固形物粉末 5.0 mg 于 50 mL 离心管，加水 10 mL，摇匀，超声 1 min促进溶解，移取 1 mL，加 1 mL 40%甲醇溶液，混匀，0.45 m 微孔滤膜过滤，色谱进样分析。液相色谱条件：参考相关文献 9,10中的方法改进，色谱条件为：色谱柱 SUPELCOTM LC-18（4.6 mm*250 mm, 5 m）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（体积比 40:60）；流速：0.8 mL/min；检测波长：267 nm；柱温： 30；进样量：10 L；分析时间：23 min。因为茶皂素是多种皂苷单体的混合物，所以在色谱图中会显示多个单体峰，
14、以单体峰面积和为茶皂素峰面积，根据标准曲线计算样品中的茶皂素含量。2 结果与讨论2.1 茶皂素含量比色法测定茶皂素含量比色法测定采用香草醛-浓硫酸与皂素的显色反应。其原理主要是：茶皂素中含有皂苷，皂苷是一类含有糖苷键的四环或五环三萜的化合物，其 C3、C12 上的羟基可与香草醛上的醛基发生反应形成缩醛，成为新的共轭体系而显色，此显色物质在可见光区有明显吸收 11。茶皂素标准品与香草醛-浓硫酸显色后，在紫外-可见分光光度计上扫描所得的最大吸收波长为456 nm。与陈莹 11报道的最大吸收波长 451 nm 相接近。在 456 nm 下测定标准工作液吸光度，以标准工作液浓度为横坐标，各吸光度为纵坐
15、标绘制标准曲线（图 1），建立回归方程：y=1.275x -0.122 4，R 2=0.993 8。可知油茶皂素的浓度在 0.20.7 mg/mL 之间是呈线性关系，且线性关系较好。图 1 茶皂素浓度与吸光度标准曲线采用香草醛-浓硫酸显色法测定油茶籽水酶法水相固形物中的茶皂素质量分数为60.97%， RSD=3.67%。2.2 茶皂素含量液相色谱法测定2.2.1 紫外吸收光谱测定水相固形物（样品）与茶皂素（标准品）分别水溶解，流动相 40%甲醇稀释，考察在 190500 nm 下的茶皂素甲醇水溶液的吸收波长。光谱扫描如图 2。图 2 可以看出，茶皂素标准溶液与样品溶液均在 267 nm 下有最
16、大吸收，且吸收光谱相类似，说明样品具有与茶皂素标准品相似的光谱吸收特性。选取 267 nm 作为液相的检测波长。图 2 样品与标准品光谱扫描图谱2.2.2 液相色谱标准曲线及色谱图以茶皂素标准工作液浓度（mg/mL ）为横坐标，峰面积和为纵坐标，作标准曲线（图 3），方程：y=179 8.5x-2.591 9，R 2=0.999 2。样品、标准品及样品加标的色谱峰如图 4。图 4 可以看出，选用的标准品与样品的色谱峰相同，说明该标准品适合作为样品的标准品进行其茶皂素含量的计算。在液相色谱图中，茶皂素标准溶液和样品溶液会出现两个主要的色谱峰，且两色谱峰面积呈现一定比例关系，且在课题研究过程中发现
17、，不同原料来源的茶皂素，此两色谱峰面积主次不同，与钟世安 12报道相同。在本课题优化的色谱条件下，两个色谱峰达到较好的分离，与文献 13中报道相比，此色谱条件具有更好的分离度，2 个主要色谱峰分别在 7 min 与 10 min 左右出峰，避开了溶剂峰出峰时间，且课题经过对液相条件优化后，两色谱峰的对称因子符合对称性要求。表明该方法更适合作为茶皂素液相测定的方法。在作标准工作曲线和计算样品中茶皂素含量时，以两色谱峰的总面积和进行计算。图 3 标准品液相色谱法标准曲线 图 4 样品、标准品及加标样品色谱图2.3 精密度吸取 0.3 mg/mL 的标准溶液 10 L 注入液相色谱仪，同一色谱条件下
18、一日内连续进样 6 次，测得的两个主要色谱峰的峰面积和分别为 541、541.3、540.2、539.1、540、538.6，以峰面积的相对标准偏差（RSD）为指标，考察仪器的精密度。RSD 结果为 0.19%（n=6），表明仪器精密度较好。2.4 重复性称取油茶籽水酶法水相固形物样品 6 份，按照上述液相色谱法样品制备与液相色谱条件操作，记录 6 个样品的色谱峰面积，结果如表 1。RSD 结果 3.0%（n=6 ），表明方法有较好的重复性。在油茶籽水酶法提油后水相固形物中茶皂素平均质量分数 54.57%，与分光光度比色法测定结果接近，表明在水相固形物中含有一半以上的物质是茶皂素。因此充分利用
19、水酶法提取油茶籽油的水相副产物，进一步浓缩或干燥制备浓缩液或水相固形物，不仅易于保存运输，而且大量的茶皂素资源可为开发环保型的天然绿色洗涤剂提供重要原料渠道。同时茶皂素的溶血、抗菌、消炎、抗高血压等活性功能，也可使大量的茶皂素资源在农业、工业以及药业等行业得到更广阔的应用前景。表 1 液相法水相固形物中茶皂素质量分数样品编号样品称样量/ mg峰面积和质量分数/ %TTS1 5.4 257.0 53.46TTS2 4.7 227.1 54.35TTS3 4.9 251.7 57.71TTS4 5.5 268.7 54.85TTS5 6.4 305.0 53.45TTS6 5.6 267.3 53
20、.592.5 检出限和平均加标回收率检出限：以 40%甲醇为溶剂，将 0.01 mg/mL 的茶皂素标准品溶液进一步稀释。以基线噪音 3 倍峰面积对应的样品中茶皂素质量分数为最低检出限，茶皂素最低检出限约为 0.2%。以基线噪音 10倍峰面积对应的样品中茶皂素质量分数为最低定量检出限，茶皂素最低定量检出限约为 0.7%。平均加标回收率：在油茶籽水酶法提油后水相固形物样品中加入不同量的茶皂素标准品，按照本研究中的样品处理方法和色谱条件测定，计算回收率，回收率为 90.88%113.13%，符合方法回收率要求。相关数据见表 2。表 2 液相法茶皂素回收率样品编号加标量/ mg回收量/ mg回收率/
21、 %平均回收率/ %RSD/ %1 1.10 1.02 92.732 1.50 1.54 102.673 3.00 3.19 106.334 3.20 3.62 113.135 3.40 3.09 90.886 4.90 4.65 94.9099.43 7.653 结论本研究建立的茶皂素液相色谱方法，是以相关报道中常采用的香草醛-浓硫酸显色法测定的水相固形物中茶皂素质量分数结果为参考依据，并同时在相关液相测定茶皂素的文献研究基础上改进得到的。该方法平均加标回收率 90.88%113.13%，精密度达 0.19%，定量检出限 0.67%，测得水相固形物中茶皂素质量分数达 54%，与香草醛 -浓硫
22、酸显色法测定结果相近，但液相色谱法具有试验易于操作、耗时短、检出限低等特点，且该液相色谱方法能更好的达到分离两个色谱峰、排除溶剂峰干扰等特点，更适合快速、准确地测定水相或预处理的水相中茶皂素含量。参考文献：1 王金元.油茶皂素的提取及纯化技术的优化D. 中国林业科学研究院,2012WANG J Y. Optimization of Extraction and Purification Technology for Camellia saponinD. Chinese Academy of Forestry, 20122 闫冬 .油茶籽水酶法制油工艺水中油茶皂素的提取纯化研究D. 湖南农业大学
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