1、1骨形成蛋白微球温敏性凝胶复合系统的制备及释药特性研究符旭东 1，刘宏，汤韧，张孟佑（广州军区武汉总医院药剂科，武汉， 430070）摘要 目的 考察了处方和制 备工艺对人重组骨形成蛋白 2（rhBMP-2）微球释放度的影响，并比较 BMP 微球和 BMP 微球温敏性凝胶复合系统的体外释药特性。方法 采用 W/O/W型乳化溶剂挥发法以聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为材料制备空白微球，通过吸附法制备 rhBMP-2 载药微球。以 单甲基聚乙二醇羟基乙酸共聚物（MPEG-PLGA）为材料制备凝胶，采用夹心法酶联免疫吸附法 测定释药速度。 结果 微球呈现三相释药模式，而微球凝胶剂体外释药曲线符合
2、Higuchi 方程。采用 PLGA-COOH 制备的 rhBMP-2 微球，其突释明显小于以 PLGA 为材料制备的微球，增加内水相与油相的体积比、在内水相中加入氯化钠均可以在一定程度上减小突释。结论 BMP 微球温敏性凝胶复合系统制备工艺，具有比 rhBMP-2 微球剂更理想的体外 释药特性。关键词：人重组骨形成蛋白2; 聚乳酸-乙醇酸共聚物；单甲基聚乙二醇羟基乙酸共聚物; 微球；温敏性凝胶；突释 Preparation of recombinant human bone morphogenetic protein-2Loaded microspheres/ thermosensitive
3、 hydrogels complex and its in vitro release characteristicFu Xu-dong , Liu Hong，Tang Ren, Zhang Meng-you（Wuhan General Hospital of Guanzhou Command, Wuhan 430030, China）ABSTRACT： OBJECTIVE To examine the effects of formulation factors on in vitro release rate of recombinant human bone morphogenetic
4、protein-2 (rhBMP-2) loaded microspheres and compare drug release profiles of microspheres and microspheres/ thermosensitive hydrogels complex. METHODS Blank microspheres were prepared with W/O/W emulsion solvent evaporation method.RhBMP-2 loaded 1 基金项目：湖北省科技攻关计划（2005AA301C38）通讯作者：符旭东，女，副主任药师 Tel/Fax
5、:(027)87649309 E-mail:2microspheres was prepared with absorption method. Thermosensitive hydrogels were prepared with MPEG-PLGA.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine drug content and in vitro release rate. RESULTS The profiles of RhBMP-2 microspheres were characterized by three pha
6、se, while the in vitro release profile of rhBMP-2 microspheres/ thermosensitive hydrogels complex conformed to Higuchi equation. The amount of rhBMP-2 released from microspheres in the initial burst phase was decresed markedly when PLGA-COOH was used to prepare microspheres instead of PLGA. Increasi
7、ng the volume ratio of internal aqueous and adding NaCL to internal aqueous phase could reduce initial release. CONCLUSION Rhbmp2 loaded microspheres/ thermosensitive hydrogels complex exerted a desirable release characteristic.KEY WORDS recombinant human bone morphogenetic protein-2; PLGA; MPEG-PLG
8、A; thermosensitive hydrogels; microsphere；initial burst release牙周病是世界卫生组织列为重点防治的、人类普遍罹患的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因，其治疗的最终目标是实现牙周组织包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生，而牙周组织再生的基础是牙周膜细胞（PDLCs） ，但在牙周损伤部位 PDLCs 的来源非常有限，以致牙周组织很难达到有效地再生和重建。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein ,BMP）是目前发现的唯一能在体内诱导骨与软骨的细胞因子，业已证实 BMP能够促进PDLCs增殖及牙周组织的修复
9、 1，但是 BMP 在体内温度和酶的作用下非常容易代谢失活，限制了其发展和应用。寻找适宜的药物递送系统一直是 BMP的研究热点之一，以生物可降解材料制备的微球或纳米粒制剂作为 BMP牙周袋局部治疗的载体受到研究者的青睐，但是这种给药系统体外释药曲线并不是非常理想，表现出一定的突释或不规则的三相释药模式 23，而且微粒制剂用于牙周袋局部给药还存在使用不便等缺点。笔者以聚乳酸-乙醇酸共聚物为材料制备 BMP微球，通过处方和工艺的优化在一定程度上可降低突释；将制备的微球分散在以聚乙二醇单甲醚/聚乳酸-乙醇酸共聚物（MPEG-PLGA ）为材料制备的凝胶中，BMP在微球凝胶复合系统中的释药速度得到进一
10、步改善。MPEG-PLGA 具有温敏性，一定浓度的 MPEG-PLGA 水溶液在室温下为自由流动的液态可以方便医生用药，3在体温下可发生胶凝而起到控制药物释放的作用。本文主要报道了处方和制备工艺对 BMP 微球以及 BMP 微球凝胶剂体外释药曲线的影响。1 材料和仪器骨形成蛋白（北京环亚泰克生物医学技术有限公司） ；聚（乳酸乙醇酸）共聚物 50/50（PLGA，乳酸: 乙醇酸比例为 50:50，分子量为 10000，山东省医疗器械研究所） ；端羧基聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH,乳酸: 羟基乙酸比例为 50:50,分子量为 10000，山东省医疗器械研究所） ，聚乙烯醇（PVA124
11、，日产进口分装，北京化学试剂公司） ；MPEG-PLGA (LA:GA:EO的比例是 8：2：1，分子量 4000-5000，PEG 分子量 1000，济南岱罡生物技术有限公司)；BMP-2 ELISA 试剂盒（武汉博士德试剂公司） 。数显式电动搅拌器（上海司乐仪器有限公司） ；JY9202D 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司） ； SK1 快速混匀器（常州国华电器有限公司） ；UV-260 型紫外分光光度计（日本岛津公司） ；SHZ 82 恒温振荡器（常州国华电器有限公司） ；BX-50 光学显微镜（日本 OLYMPUS 公司） ；S450 扫描电镜（日本 HITACHI 公司
12、） ；ALPHA1-4 冷冻干燥机（CHRIST, 德国） 。2 实验方法2.1 BMP 微球的制备 空白微球采用 W/0/W乳化溶剂挥发法制备，取适量水加入到 2ml含有200mg PLGA的二氯甲烷中，冰浴条件下超声 30s，然后将其倒入 15ml 3的PVA溶液中，冰浴条件下 600rpm搅拌 10min后，将转速降至 300rpm加入 35ml水，在室温下继续搅拌 4h，然后过滤，洗涤，真空五氧化二磷干燥 48h。BMP微球通过吸附法载药，将 10mg空白微球混悬在 100l 含 50gmL-1的BMP2.5甘氨酸缓冲液中， 4下吸附 24h 后冷冻干燥。2.2 BMP 微球凝胶的制备
13、称取 MPEG-PLGA 4g 置于 20ml 水中，搅拌后静置于 4冰箱中，并时时振荡，待 MPEG-PLGA 充分溶胀后，即得 20MPEG-PLGA 水凝胶。取 10mg载药微球，加入 2.5ml 凝胶，在冰浴条件下充分混匀，即得含 BMP 2gmL-1 的微球凝胶。42.3 BMP 微球及微球凝胶 剂体外释放度的测定 4将载有 5gBMP 的微球分别混旋在 2.5ml 的 0.1molL-1 pH7.4 的磷酸盐缓冲液、10和 20的 MPEG-PLGE 水溶液中，精密量取 0.1ml 分别置于 1ml 的离心管中，加入 1 ml pH7.4 的磷酸盐缓冲液，置于恒温振荡器中，振荡速度
14、为100rmin-1、温度为（371），分别在 0.5h、1、3、5、7、14、21 和 28d 取样，2000rpm 离心 10min 后，弃掉上清夜，沉淀物中加入 1mlPBS，超声15min，2000rpm 离心 10min 后，取上清液 0.lml 按 1:10 比例稀释后，采用夹心法酶联免疫吸附法测定样品中残留的药物，通过标准曲线计算 BMP 的含量，该方法的检测范围 62.54000pg/ml，每份样品平行测定 2 次。释放度为释放前后系统中的药物含量之差与释放前系统的药物含量的百分比。2.4 微球粒径及表面形态观察用光学显微镜及扫描电镜观察微球的外观形态，测定不少于 200 个的
15、粒径，计算算术平均粒径。3 结果与讨论3.1 内水相与油相的体积比对 BMP 微球初始释药 行为的影响以 PLGA50/50为材料，考察当内水相与油相的体积比分别为 1:5、1: 10和1:20 时微球的形态和释药行为。如图 1所示，随着内水相与油相的体积比的增加，微球的粒径没有明显的变化（大约在 2030m） ，但是微球表面的孔洞增加 5，微球在 0.5h3d 的释放度降低。这可能因为 BMP是通过吸附作用载药的，随着内水相体积相对减少，微球内部和表面的孔洞减少（见图 2） ，微球与 BMP溶液接触面积减少，bmp 被吸附的量减少，没有被吸附的 BMP在释药初期很快扩散到释放介质，微球的突释
16、增加。50204060800.5 24 72t/h累积释放度/内 水 相 ： 油 相 1： 5 内 水 相 ： 油 相 1： 10 内 水 相 ： 油 相 1： 20图 1 内水相与油相的体积比对 BMP 微球 072h 释药 行为的影响图 2 内水相与油相的体积比对 BMP 微球形态的影响内水相和油相的体积比 A 1:5 B 1: 10 C 1:203.2 内水相中氯化钠含量对 BMP 微球初始释药行 为的影响将内水相与油相的体积比固定在 1:5，用 10的氯化钠溶液替代水作为内水相，可以发现微球表面的孔洞明显增加（如图 3所示） ，因为随着内水相渗透压增高，外相的水更容易进入微球的内部，表
17、面的孔洞明显增加（见图 4） ，和“3.1”项下观察到的结果相似微球在 0.5h3d 的释放度显著降低。这可能同样是因为 BMP是通过吸附载药，微球内部和表面的孔洞为 BMP溶液的渗透提供了很多的通道，有利于药物的吸附。10mA10mB10mC601020304050600.5 24 72t/h累积释放度/未 加 NaCL 含 10 氯 化 钠图 3 内水相中氯化钠含量对 BMP 微球 072h 释药 行为的影响图 4 内水相与油相的体积比对 BMP 微球形态的影响A 内水相中未加氯化钠 B 内水相中含 10氯化钠3.3 PLGA 及 PLGA-COOH 对 BMP 微球释放度的影响如图 5所
18、示，采用 PLGA-COOH制备的微球在 0.5h3d 的释放度明显低于PLGA微球，这是因为 BMP是一种碱性蛋白（等电点在 9.0左右） ，可与 PLGA-COOH分子链中的羧基可以发生离子相互作用而使 BMP吸附量增加 6，因此PLGA-COOH微球中未吸附的 BMP减少，突释明显降低。20mA 20mB701020304050600.5 24 72t/h累积释放度/PLGA PLGA-COOH图 5 PLGA 种类对 BMP 微球 072h 释药行为的影响3.4 MPEG-PLGA 浓度对微球凝胶剂中 BMP 释放度的影响如图 6 所示，BMP 微球表现出三相释药模式 7：01d 的快
19、速释放期。这是由于表面未吸附药物快速溶解所导致的，约有 30左右的药物释放；第1d5d 的时滞期药物释放速度非常缓慢，这是因为吸附于微球表面的药物已经释放完毕，而 PLGA 的降解速度较慢，分子量为 12.1KDa 的 BMP 很难从微球中扩散出来；第 5d14d 后释药速度明显加快，是由于随着 PLGA 逐渐降解成水溶性小分子，微球内部和表面的孔隙增大，为药物的扩散提供了更多通道。BMP 微球凝胶剂没有表现出明显的三相释药模式，体外曲线符合 Higuichi 方程，r=0.9884。其突释明显低于微球剂，而在 15d 的释药速631.542.1tQ度又略快于微球剂，可能是混悬在凝胶中的微球就
20、像是包上了一层衣，高粘度的凝胶层，降低了微球上未被吸附的 BMP 向介质扩散的速度。 BMP 微球凝胶剂在 514d 也没有像微球剂那样呈现快速释放的特征，这是因为凝胶层阻止了水分的渗透，PLGA 降解速度减慢所致。80204060801000 4 8 12 16 20 24 28t/d累积释放度/%微 球 微 球 凝 胶图 6 MPEG-PLGA 浓度对 BMP 微球释药曲线的影响4 结论本文比较了 BMP微球和 BMP微球凝胶剂的体外释药特征，同时还考察了处方和制备工艺对 BMP载药微球释放度的影响。研究表明 BMP微球呈现三相释药模式，而 BMP微球凝胶剂体外释药曲线符合 Higuchi
21、方程，控释效果更理想。研究结果还显示采用 PLGA-COOH制备的 BMP微球，其突释明显小于以 PLGA为材料制备的微球，增加内水相与油相的体积比、在内水相中加入氯化钠均可以在一定程度上减小突释。参考文献1 赵征，张广耘.bFGF 和 rhBMP对牙周膜细胞增殖和胶原酶水平的影响D.青岛：青岛大学，2002.2 Schrier JA.,Deluca PP. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 bingding and incorporation in PLGA microsphere delivery systemsJ.Pharm D
22、evelop and Tech,1999,4(4):611621.3 Schrier JA.,Deluca PP.Porous bone morphogenetic protein-2 microspheres:polymer binding and in vitro releaseJ. AAPS Pharmscitech 2001,2(3) article174 Chung Yong-Il, Ahn KM, Jeon SH.,et al. Enhanced bone regeneration with BMP-2 loaded functional nanoparticlehydrogel
23、complex J. J of Control Release, 2007,121: 9199.5 Han K, Lee KD, Gao ZG, et al. Preparation and evaluation of poly (L-lactic acid)microspheres containin rh EGF for chronic gastric ulcer healing J. J of 9Controlled Release, 2001,75(3):259-271.6 Duggirala SS, Mehta CC, and DeLuca PP. Interaction of recombinant morp-hogenetic protein-2 with poly (d,l-lactide-coglycolide) microspheres. Pharm. Dev. Technol. 1996, 1:1119.7 Zolnik BS, Burgess DJ. Evaluation of in vivo-in vitro release of dexamethasone from PLGA microspheres J. J Control Release.,2008 ,21;127(2):137-45.
