1、 1 毕业设计 开题报告 纺织工程 蜘蛛丝蛋白 /聚吡咯复合纤维膜细胞相容性研究 一、选题的背景、意义 组织工程材料是当前生命科学和材料科学共同的前沿研究热点之一。目前已经开发应用于组织工程等生物医学领域的生物相容性高分子材料主要有胶原蛋白、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等，但大多数这类材料的原创性研究工作属于国外。我国是一个人口大国，因创伤和疾病造成的组织、器官丧失或功能障碍病例居世界各国之首，每年仅因烧伤需进行皮肤移植的患者就达百万之多。因此，积极寻找合适的原料，研制具有我国自主知识产权的生物材料，对于减小我国组织工 程支架等生物材料对国外的依赖性，培育新的高新技术产业和实现国民经济的可持续发
2、展具有重要意义。 研究者一直在寻找具有良好的生物相容性的支架材料以应用于细胞培养中，以及研究支架材料在细胞培养中的各项性能指标以及实验环境对细胞培养的影响，了解细胞在支架材料上的生长情况，以便更好的应用在临床中 1。而导电支架细胞培养技术发展迅速，是近年来研究的热点。本文主要选择 蜘蛛丝蛋白和聚吡咯复合 制得的支架材料 ，将细胞培养在带电的支架材料上，重点研究培养过程中支架材料的性质、电刺激的电流强度及电刺激的时间长短对细胞再生的影响。 二、相关研究的最新成果及动态 2.1 蜘蛛丝蛋白的概况和研究现状 2.1.1 蜘蛛丝蛋白的概况 蜘蛛丝的主要成份为蛋白质，如所有的蛋白质纤维一样，其组成长链蛋
3、白质的单元为带不同侧链 R的酰胺结构，同尼龙 2结构相似 2。蜘蛛丝的氨基酸的摩尔分数和氨基酸的主链序列与天然聚肽如蚕丝、羊毛和人头发有很大的差异。这种差异和组成取决于蜘蛛的种类、食物、气候及其它因素。不同蜘蛛丝所含的氨基酸种类差异不大，为十七种左右，各种氨基酸的含量也因蜘蛛的种类不同而有一定的差异。它们的共同点为具有小侧链的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的含 量丰富，十字圆蛛和大腹圆蛛的这两者含量之和分别达到 59.6和 53.2%与蚕丝的含量 74.0相比较就显得较低 3。 蜘蛛丝是一种特殊的蛋白纤维，它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗断裂功能，2 以及轻盈、较耐紫外线、生物可降解等优点，
4、作为一种新兴的功能材料具有得天独厚的条件，是其他纤维材料无法比拟的，可以作为高性能的生物材料如人造肌腱、人工韧带、人工器官、组织修复等组织工程新材料，正逐步受到生物学、医学、材料科学等学科领域研究者的重视，具有十分诱人的应用前景。 2.1.2 蜘蛛丝蛋白的研究现状 组织工 程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，材料在组织工程中起关键作用，成为组织工程研究的一个主流。生物材料的研究经历了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性质的材料，现已发展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料 4。人们开始从生命科学的角度研究和设计生物材料，注重材料与细胞的相互作用，改变以往采用惰性材料的作
5、法，将生物的某些功能引入材料。丝蛋白纤维材料因具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞粘附活性和独特的机械特性，以及其本质是蛋白质的结构特点，使丝蛋白纤维 (膜 )在生物医学领域得以广泛的 应用，成为在组织工程领域人们重新感兴趣的一类特殊的生物材料。 苏州大学的刘敏 5等人对过对大腹园蛛主腺体内丝蛋白分子量和基酸组成的测定和分析，研究表明蜘蛛主腺体丝蛋白的氨基酸组成以甘氨酸、氨酸和谷氨酸为主，同时含有较多的脯氨酸和酪氨酸，与牵引丝的组成有一定差异；丝蛋白中甘氨酸、脯氨酸的含量比丝纤维中的含量更高，而丙氨酸的含则低于丝纤维，牵引丝纤维中丝氨酸的含量高于其在腺体内丝蛋白中的含量，且成丝后小侧链氨基
6、酸含量增加，酸性氨基酸含量减少。 L0mbardi&Kap6的研究表明蛛丝纤维不溶于水、稀酸或稀 碱、尿素和大多数有机溶剂，同时它们对大多数蛋白酶也具有相当强的抵抗力。另外， Melloml 等 18的研究也表明蛛丝纤维能溶于高浓度的盐溶液如溴化锂、硫氰酸锂、氯化钙以及其他钙盐。 Min7等人将人体角化细胞和纤维原细胞种植在静电纺丝制得的蜘蛛丝纤维毡上，在实验室条件下培养了 7 天，用 SEM 观察纤维毡上的细胞形态， 3 天后发现细胞已经在丝素纤维表面黏附、繁殖，并开始通过纤维表面孔隙迁移，进入支架内部；与此同时，这些细胞与周围纤维相互融合，保持表型并按纤维的取向方向生长，形成一个三维的纳米
7、纤维网状结构。 Jim8等人也对人骨髓干细胞在静电纺丝素纤维中的生长进行了研究，他们将细胞种植在由丝素和 PEO共混后静电纺制备的纤维毡上，培养 7天后，用 SEM观察后发现，这种与细胞外基质结构相似的纳米纤维毡促进了细胞的黏附和增殖，有很好的生物相容性，可作为生物支架材料使用。 同时对蛛丝作为生物材料的研究报道较少，英文文献报道了用蛛丝包卵丝制备用于软骨生长的多孔 3D支架 9和用蛛丝弹性蛋白制备培养盘包被材料培养软骨细胞的研究 10，此外 Vollrath F3 等 11利用哺乳动物伤口讨论天然蛛丝的组织相容性；而国内以蛛丝蛋 白为材料制备组织工程材料除陈登龙关于 RGD-重组蛛丝蛋白复合
8、支架材料的研制 12也未见相关报道。 2.2 聚吡咯 2.2.1 聚吡咯的研究进展 有吡咯黑之称的聚吡咯粉末早在 1916年就已合成出来， 1968年 Dallolio用电化学方法制备出了聚吡咯，电导为 8/cm，自 Diaz等报道了含有 1%乙腈溶液中制备出金属电导的、热稳定的聚吡咯以来 13由于聚吡咯制备工艺相对简单，易于合成出各种各样的衍生物、共聚物和复合材料以得到较宽范围的电导率及其它特殊性能的材料，因此对聚吡咯的研究日益增多。 2.2.2 聚吡咯 的生物相容性 导电高分子的表面特性，如电荷密度和可润湿性等，可在电势存在下发生可逆性变化。电荷密度和湿润性等表面特性，在蛋白吸收和细胞 -
9、底物相互作用中发挥着关键作用。因此， PPy 是组织工程中一种重要的备选材料。而导电 PPy 制成的执行元件可在水溶液中工作，在生理环境具有应用前景。 吴坚等 14 用化学合成的 PPy 粉末提取液，进行了急性和亚急性毒性试验、热源实验、 MTT、溶血实验、过敏实验、微核试验、皮肤刺激试验和眼结膜刺激试验，结果显示 PPy 是无毒、无致病原、不引起溶血和过敏、也无致突变和刺激作用的材料， 具有良好的生物安全性。 2.2.3 聚吡咯在组织工程中的应用研究 Guido in15等报告了有关聚吡咯膜在组织工程中的应用实验。用编织聚酯制成小直径的管 , 在上面用聚吡咯包被 , 然后移植到小鼠的体内 ,
10、 观察体内的反应以及血管上皮细胞在其上的增长情况。磁共振研究和生物学研究显示 , 电阻率较高的聚吡咯复合材料在整个移植过程中引发的组织反应最低 , 这和它在体外试验结果一致。 Schmidt16以聚乳酸 2羟基乙酸共聚物 (PLGA )做支持物 , 将较薄的聚吡咯植入老鼠体内 ,14 周后 ,PLGA已被降解 , 聚 吡咯没有变化 , 没有负性组织增生和炎症的反应。她又尝试将 ECM 中的一种 透明质酸掺杂到聚吡咯中合成新的复合物 17 (聚吡咯 -HA )。这种复合物在体内起促进血管生成的作用。聚吡咯 -HA 在那些既能从电刺激中得到好处又需要增强血管生成作用的组织工程和伤愈应用中是很好的候
11、选物。聚吡咯是一种适合做组织生长支架的聚合物 ,可以用于刺激神经细胞、骨细胞再生、血管移值以及体外肝脏的培植等组织工程学领域。聚吡咯用于伤愈再生和组织工程的优点是 : (1)加电的区域定位准确； 4 (2)聚吡咯便宜且易于合成 , 通过加入不 同的掺杂分子以及加电与否 , 可以获得不同的表面特性 , 使得在同一表面不同区域获得与细胞粘连和不粘连的表面格局成为可能。从而在同一表面可获得清晰分界的不同生长阶段的细胞； (3) 基质类似物和生长因子可以偶联到聚吡咯载体上并依次释放 , 给神经甚至骨的再生提供多种刺激。 2.3 支架材料研究现状及发展趋势 2.3.1 支架材料在组织工程中的作用 在组织
12、工程中，种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子并称为组织工程的三大基本要素，构建组织工程化人体组织或器官涉及种子细胞在生物反应器中大规模培养、扩增，生物 力学信号施加和化学信使 (生长因子或细胞因子 )的控制释放等关键技术。其中，支架材料在组织工程研究中起中心作用，它不仅为特定的细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。支架材料在组织工程中的具体作用主要如下 18： (1)支架材料的结构和形貌控制再生组织的结构、尺寸和形貌，作为连接细胞和组织的框架，引导组织生长成特定形态； (2)作为信号分子的载体，将信号分子运送到缺损部位，并作为缓释体使诱导因子缓慢发挥作
13、用，为工程化的组织提供一个赖以存在的空间，引导组织的再生和成长； (3)作为 组织繁殖分化和新陈代谢的场所，为细胞生长输送营养、排除废物； (4)支架表面特殊位点与组织起特异性反应，对不同类型细胞起“身份鉴别”及选择粘附的作用； (5)起到机械支撑作用，可以抵抗外来的压力，并维持组织原有的形状和组织的完整性； (6)支架材料还可以作为活性因子的载体，用来承载一些生物活性物质，如生长因子，为细胞的生长、分化和增殖提供养分。 2.3.2 支架材料及发展 生物材料的发展经历了以下 3个阶段： (1)沿用通用高分子材料。如涤纶 Dacron用于血管移植物，醋酸纤维酯用做血液透析膜等，但此类材料存在 生
14、物相容性问题。 (2)应用生物医用高分子材料即生物相容性材料。美国食品药品管理署 (FDA)已批准聚乳酸 (PLA)、聚乙醇酯 (FGA)及其共聚物 (PLGA)和医用聚氨酯 p功等应用于医药装置。 (3)细胞特异性材料。随着组织工程的发展，对相关生物材料提出新的挑战，除了生物安全性和生物相容性外，还希望植入的生物材料装置不为免疫系统排斥而且更能产生所期望的宿主响应：将生物材料推向第三阶段。其研究和开发有赖于5 从细胞、分子乃至基因水平深入了解宿主生物材料之间的相互作用。正如 1998年 11月美国当代生物材料相关会议的共识 ：以往生物材料的研究和开发大多从材料的化学性质、物理性能及其加工方法
15、方面构思，而未从细胞和分子水平进行生物材料设计 19。 生物材料的研究对组织工程的研究是至关紧要的。虽然许多生物材料都可介导细胞的生长，然而，由于体内的组织生长再生包括骨、神经、血管等的介导生长或角膜上皮细胞的生长等过程，这就要求细胞接受更多的特异性指令。因此理想的组织工程支架材料必须能与细胞所表达的特异性粘附与生长因子受体相互作用，并能引导这些细胞迁移至受损部位且促进它们的生长和分化；此外，在组织修复的过程中，支架还必须能在细胞所分泌的 基质重构酶的作用下逐渐降解 20。因此，随着组织工程研究的深入，对于支架用生物材料的要求也更高了。为使组织工程支架用的生物材料具有生物功能化的特点，以及对生
16、物信号作出反应，一般可通过在材料中引入细胞粘附肽段和蛋白酶来对材料进行仿生化设计，使之达到材料生物功能化的目的。 支架材料是组织工程技术成功的关键，支架材料表面的空间拓扑结构，尤其是材料表面的粗糙程度、微观形貌结构、立体结构、孔隙的大小及分布等均对细胞的形态、粘附、生长及功能有重要影响，其中纳米高分子支架材料有利于细胞粘附、定位、增殖和分化，使其在组织 工程领域具有诱人的应用前景，已成为当今组织工程的研究热点。由静电纺丝制得的纤维具有纤维纤度细、表面积大、孔隙率高的形态特点而可作为细胞生长的多孔支架，促进细胞的迁移和增殖广泛用作组织工程及生物医学工程材料。但静电纺丝技术目前仅停留在实验室阶段、
17、静电纺丝产量很低，还有许多理论和技术问题需要进一步研究。相信随着研究工作的逐步开展和不断深入，静电纺丝将成为纳米高分子支架最重要的加工方法之一。 2.4 电刺激 2.4.1 电刺激的发展 1953年 Yasuda21报告了骨的压电性能，并经实验证明 1uA的恒流直流电 可刺激兔股骨新骨形成后，人们才初步认识到了骨的机电效应在骨生长修复及重建过程中的作用。到了 20世纪 60 年代初 ,Bassett22等在测量湿骨机电效应的过程中 ,发现在骨悬梁实验中 ,梁的压缩侧和拉伸侧分别为负电位和正电位。此后他们的进一步实验结果还表明微安级电流诱导就能够加速新骨的形成 ,且形成的新骨位于阴极附近。他们认
18、为负电荷能引起骨生长 ,正电荷可以引起骨吸收。Friedenberg23（ 1971）报道了现代第一例直流电刺激治疗骨不连接病人。从 70年代后期开始 ,人们对电刺激促进组织的再生作用进行了大量 的基础和临床研究 ,希望通过电刺激方法促进神经损伤后功能的恢复 ,减轻后遗症状的发生 ,并取得了很大的进展。 6 电刺激对神经再生的影响早已被国内外学者所注意和认识， 1976年 Wilson24应用间断电刺激治疗鼠正中神经和尺神经损伤，发现损伤远段神经纤维数量增加，神经传导速度加快。 1983年 Raji25证实脉冲电刺激能促进鼠坐骨神经功能恢复，并能增加神经损伤段和远段再生轴突的直径， 加速神经损
19、伤远段 Wallerian氏变性，提高神经再生速度。但其机理尚不十分清楚， Zanakis26认为神经的再生能力与电 场引起的血液循环改善有关； Borgens27发现电场是神经的营养剂，并认为这是首要的作用，而不是第二位的； Pomeranz28推测有一种朝向负极的电泳效应也可吸引正电荷分子，而神经生长因子带有较强的正电荷，因而在电场作用下向负极移动；有学者从不同角度解释电场对神经的影响。 目前，微量直流电刺激具有促进骨痂形成、神经再生的观点已被证实，但尚缺乏定量研究以确定最佳电流强度和密度。电刺激在临床的应用尚有一些问题没有解决 ,譬如何时开始治疗 ,最佳刺激方式 ,刺激电流的选择、 电刺
20、激 持续 的 时间等问题尚有待于进一步明 确。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法、技术路线及研究难点，预期达到的目标 (一 ) 研究内容： 用 静电纺丝法和原位聚合法制备蜘蛛丝 /聚吡咯复合纤维膜 ， 研究复合纤维膜的电导率、降解率和通过复合纤维膜对 PC12 细胞实施的电刺激对细胞的活性、增值的影响 。 (二 ) 研究方法： 查阅相关的文献，了解蜘蛛丝 /聚吡咯复合纤维膜的性质及组织工程的研究进展。利用各种实验资源，对蜘蛛丝 /聚吡咯复合纤维膜进行表征和生物相容性的研究。对实验数据进行处理，分析和讨论实验结果 (三 ) 技术路线： 蜘蛛丝 /聚吡咯复合纤维 膜制备 膜表面的观察、测定 台
21、盼蓝检测细胞活性 L929,PC-12细胞培养 种植 L929细胞 MTT法检测细胞毒性（生物相容性） 种植 PC-12细胞 MTT法检测细胞增殖 使用不同电流电刺激 2d 使用相同电流电刺激不同时间 7 MTT法检测细胞增殖、观察细胞形态 得到一组有利于 PC-12细胞砸在材料上生长的的电刺激条件 (四 ) 研究难点：对种植在 蜘蛛丝 /聚吡咯复合纤维 膜上 PC-12细胞进行电刺激实验。 四、论文详细工作进度和安排 2010.10.19 2011.1.10 查阅文献，翻译英文，写出文献综述，完成开题报告。 2011.1.11 2011.1.25 确定实验方案，准备原材料。 2011.1.2
22、6 2011.3.31 完成实验、测试工作，并做好记录。 2011.4.1 2011.4.14 完成论文初稿。 2011.4.15 2011.5.4 对论文进行修改，并做相关的补充实验。 2011.5.4 2011.5.12 完成对论文的修改，并最后定稿。 五、主要参考文献 1 陈兴泳 , 唐洲平 , 唐荣华 . 神经组织工程生物支架材料生物相容性研究进展 J. 中国康复理论与实践 , 2008, 3:56-57. 2 华坚，吴大诚纳米纤维蜘蛛丝的分子和形态结构 J 21世纪高技术、高性能、高附加值新型化纤发展论坛 2004:263-271. 3 潘志 娟，盛家镛，陈宇岳大腹圆蛛牵引丝的结构与
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