1、中华血液学杂志 2003 年 12 月第 24 卷第 12 期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.121转 mdrl 基因诱导 CIK 细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性杨永红 李惠芳 石永进 王逸群 张英 王奕嘉 朱平摘要 目的 将多药耐药基因(mdr1)转入细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer，CIK)细胞，观察其是否产生耐药性并且保持肿瘤杀伤活性。方法 用 IFN-，CD3单抗，IL-2 ，IL-1 等细胞因子体外诱导外周血单个核细胞获得 CIK 细胞。采用电穿孔方法将 mdr1 基因表达质粒 pHamdr，转入 C细胞
2、。转染后 72h 提取细胞总 RNA，DNA 酶消化残留质粒 DNA 后进行 RT-PCR，鉴定 mdr1 基冈表达；流式细胞仪检测细胞膜耐药蛋白(P-gp)表达。四唑蓝比色法(MTT) 检测转基因后 CIK 细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性；同时检测转染前后 CIK 细胞对 MCF7 细胞( 人类乳腺癌细胞系)的杀伤活性变化。结果 转染 mdr1 后的 CIK 细胞 mdr1 mRNA 阳性，P-gp 阳性的 CIK 细胞为 2137(平均 27)。转染后 CIK 细胞获得了多药耐药性，对阿霉素的 IC50 值较转染前升高了 223458 倍，对秋水仙碱的 IC50 值升高了 671135 倍
3、。转染前后 CIK 细胞对 MCF7 肿瘤细胞的杀伤活性无明显变化(P 005) 。结论 CIK 细胞转入 mdrl 基因后获得了多药耐药性，转染后的 CIK 细胞仍然保持原有的肿瘤细胞杀伤活性。关键词 基因，mdr1 ； 抗药性，多药； 杀伤细胞，细胞因子诱导； 基因转染CIK cells acquired multidrug resistance and maintained cytotoxic aetivity to tumor cells after mdrl gene transfection YalGYong-hong， LI Hui-fang， SHI Yong-jin， WAN
4、GYi-qun， ZHANGYing， WANG Yi-jia， ZHU Ping. Beijng Univensity Finst Hospital， Beijing 100034， ChinaAbstract Objective To investigate whether the cytokine-induced kilier (CIK ) cells could acquire multidrug resistance and maintain the original cytotoxic activity after multidrug resistance (mdr1) genes
5、 transfection. Methods CIK cells were generated from peripheral blood cultured with IFN-，CD3 monoclonal antibody，IL-2 ，IL-1 and transfected with a plasmid (pHamdr) containing human mdrl gene via electroporation，RT-PCR method was used to assay mRNA expression of mdrl gene in transfectec CIK cells，flo
6、w cytometry with anti-P-gp monoclonal antibody to detect P-glycoprotein (P-gp) expression on CIK cells membrane，and MTT assay to compare both the multidrug resistance to doxorubicin and colchicines and cytotoxic activity to human mammary cancel cell line MCF7 between transfected and non-transfected
7、CIK cellsResult mdrl expressmn was detected in the transfected CIK cells. There was a strong expression of P-gp on the transfected CIK cells and the percentages of P-gp positive cells were 2137(average 27). The IC50 of transfected CIKcells to doxorubicin was 223458 times and 67 1135 times to colchic
8、ines of those of non-transtbcted CIK cellsThe cytotoxic activity to MCF7 remained unchanged(P005)Conclusion It demonstrated that CIK cells transfected with mdrl gene via electroporation could express multidrug resistance successfully without changes of cytotoxic activityKeywords Gene，mdrl； Multidrug
9、 resistance； Killer cells，cytokine-induced； Gene transfection细胞免疫治疗是肿瘤治疗中一种重要的辅助治疗方法，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞因其可体外大量扩增，细胞毒活性强，不良反应少而倍受关注。临床应用时已观察到，在微量残留病期将 CIK 细胞输注患者体内，可以减少肿瘤的复发，甚至有希望彻底治愈肿瘤。中华血液学杂志 2003 年 12 月第 24 卷第 12 期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.122但是由于肿瘤细胞并不能在几个疗程的化疗中完全被杀灭，而 CIK 细胞本身又对化疗药物
10、敏感，不可能同时进行化疗和 CIK 细胞免疫治疗，大大限制了 CIK 细胞的应用。如果能将多药耐药基因转入 CIK 细胞使其产生耐药性同时保持其杀伤肿瘤细胞活性，则有可能解决这个问题。我们应用电穿孔方法将 mdrl 基因转入 CIK 细胞，观察转基因对其产生耐药性以及对肿瘤细胞杀伤活性的影响。材料和方法1 制备 CIK 细胞 1 经 CS-3000 (Baxter 公司产品) 血细胞分离机初步采集 5 例淋巴瘤患者外周血单个核细胞(PBMNC)，再用 Ficoll 液分离，经 PBS 洗涤 3 次后培养于含 10胎牛血清的 RPMl 1640(GibcoBRL 公司产品)培养基中，细胞密度 1
11、X106ml，第一天培养加入 IFN-1 000Uml ，24h 后加入 IL-2 1000 Uml，CD 3 单抗 50ngml 及 IL-1 500Uml (以上均为终浓度) ，每 3d 更换培养液一次并补加 IL-2，浓度同前；培养 13d 后收集 CIK 细胞待用。用抗 CDB、CD56 单抗采用流式细胞仪对细胞表型进行鉴定。2 mdrl 基因转染 ClK 细胞 质粒 pHamdr 由美国 Gottesman 博士惠赠，mdrl 基因全长cDNA 4 400bp，来自人类多药耐药 KB 细胞系。收集对数生长期 CIK 细胞，细胞计数后用无血清 RPMI 1640 制成 1X107ml
12、的单细胞悬液，并按 40gml 加入质粒 pHamdr，选择间隙为 4mm 的电转杯，电压 280V，脉冲宽度 20ms，单脉冲，应用方波电穿孔仪 (BTX公司产品，ECM830 型)进行基因转染(电穿孔后细胞的死亡率为 2942，平均为 36) 。转染后细胞子含 10胎牛血清的 RPMl 1640 培养液中继续培养，细胞密度为 5X106ml，并按 500Uml 加入 IL-2。实验设立对照组以空质粒(pcDNA30)代替目的质粒 (pHamdr)进行基因转染，方法同上。转染后 CIK 细胞经锥虫蓝染色计数细胞死亡率。3 mRNA 水平检测，RT-PCR 扩增目的基因片段 应用 TRIzol
13、 试剂盒(GibcoBRL 公司产品)提取 CIK 细胞总 RNA，DNA 酶消化可能残留的质粒 DNA 后，应用随机引物和反转录酶试剂盒(Promega 公司产品)反转录合成 cDNA 第一链。PCR 总反应体系体积为25l，其中含扩增耐药基因的上下游引物各 10pmol，dNTP(含dATP，dCTP，dGTP，dTIP)01 mmolL ，1 U Taq 聚合酶和 3l 的 cDNA 产物，1XPCR 缓冲液 10mmolL Tris-HCl (pH 83)，50mmolL KCl，15 mmolL MgCl2，及 01Triton-X100)。PCR 扩增条件：94预变性 5min；9
14、4变性 30s，55 退火30s，72延伸 30s，共 25 个循环；720C 延伸 10min，反应结束后产物于 4保存。PCR产物用 60gL 聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染鉴定。mdrl 上游引物序列为：5-CATYGGTGTGGTGAGTCAGG-3，下游引物序列为：5ACAGAAAGCGAAGCAGTGGT-3， ，目的片段长度为 300bp。同时扩增 F-actin 作为检测cDNA 的指标，上游引物序列为 5ATCTGGCACCACACCTYC 3，下游引物序列为：5，AGCCAGGTCCAGACGCA-3， ，目的片段长度为 291bp。引物由博雅公司合成。 4 流式细胞仪检测 CI
15、K 细胞 P-gp 的表达 转染后 72h 收获 CIK 细胞制成单细胞悬液，PBS 液洗涤 2 遍后加入小鼠抗 P-gp 单克隆抗体(JSB-1 克隆系，阴性对照组用无关抗体代替 )4 避光反应 45 min， PBS 洗涤 2 遍，加入 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG，4避光反应30min，PBS 液充分洗涤后用 1多聚甲醛固定，应用流式细胞仪(美国 BD 公司，FACSort型) 检测细胞结合的抗体荧光强度，激发波长为 488nm，经 Cell Quest 软件处理获得 Log 荧光直方图，并得出荧光阳性细胞百分比。以上所用抗体购自北京中山生物公司。 5 四唑蓝比色法(MTT)检测
16、CIK 细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性 分别将转染前及转染后的 CIK 细胞用含 10胎牛血清的 RPMI 1640 培养液制成 2 X106ml 单细胞悬液，接种于 96 孔培养板中，100l 孔，加入五种不同浓度(10 -410 0 mgm1)的阿霉素 (Sigma公司产品)或不同浓度(10 -510 -1gml)的秋水仙碱(Sigma 公司产品)，每种浓度设立 4 个重复孔，转染前和转染后对照进行，此外还设立空白对照组和转染前、转染后未用药组。中华血液学杂志 2003 年 12 月第 24 卷第 12 期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.1
17、23培养 72h 后加入 5 mgml 的 MTT(Sigma 公司产品)10 l/孔，继续培养 4 h 后 1 000rmin离心 10min，去上清，加入二甲基亚矾(DMSO)200l/孔，振荡 10min，使蓝色结晶物充分溶解后用 ELISA 检测仪测定吸光度 (A，波长 570nm)值，计算细胞生存率，药物杀伤率及半数抑制浓度(IC 50)2，比较转染前后 CIK 细胞的耐药性。 6 MTT 检测转染前后 CIK 细胞对 MCF7 细胞的杀伤活性 3 本实验室保存的人乳腺癌肿瘤细胞系 MCF7 常规复苏后培养在含 10胎牛血清的 RPMI l640 培养液中，应用对数生长期的细胞作为靶
18、细胞，按 2X105ml 接种于 96 孔培养板中，100l 孔，CIK 细胞按效靶细胞比(E： T)为 5：1，1 ：1，1：5 分为 3 组接种，每组设立 8 个重复孔，另外同时设立空白对照组，相应细胞密度的转染前、后 CIK 细胞和 MCF7 细胞培养组。培养 24h 后离心去除上清，加入 DMSO 溶解，ELBA 检测仪测定A 值，方法同上，计算杀伤率。ACIK+MCF7ACIK杀伤率() = (1 )x100 AMCF7 A 空白7 统计学处理 转染前和转染后 CIK 细胞之间的比较采用配对 t 检验。结 果1 培养后获得 CIK 细胞 CD3+CD56+ 细胞的大量扩增是 CIK
19、细胞的特点，5 例单采的PBMNC 在培养前 CD3+CD56+ 细胞占 439549，经过加入一系列的细胞因子按照CIK 细胞的培养方法体外培养 13d 后 CD3+CD56+ 的细胞占 20873350，符合 CIK细胞的特点。2 转染后 CIK 细胞 mdrl 基因 mRNA 的表达 RT-PCR 显示转染前 CIK 细胞，转染空质粒 CIK 细胞以及转染 mdrl 基因 CIK 细胞三组均在 291bp 处出现对照 - actin 的目的条带；转染 pHamdr 后的 CIK 细胞组在分子标记 300bp 处可见 mdrl 基因的目的条带，即 mdrl 基因的 mRNA，转染前的 CI
20、K 细胞、转入空质粒的 CIK 细胞均无 mdr1 基因的表达。转染mdrl 基因的 CIK 细胞 RNA 经 DNA 酶处理后直接进行 PCR，结果未见 300bp 的 mdrl 基因目的条带，可以排除由残余质粒造成的假阳性结果(图 1)。 3 转染后 CIK 细胞 P-gp 表达 经流式细胞仪检测，转染 mdrl 基因的 CIK 细胞表现为双峰曲线，出现了 P-gp 的第二个峰，阳性细胞率在 2137。转染空质粒以及未转染基因的 CIK 细胞均只见一条单峰曲线，即无 P-gp 表达的细胞，表明转染 mdrl 基因的 CIK细胞在蛋白水平成功的表达了耐药蛋白 P-gp(图 2)。 4 转染前
21、后 CIK 细胞对阿霉素和秋水仙碱耐药性的比较 MTT 药敏实验结果表明，转染 mdrl 基因后的 CIK 细胞对阿霉素、秋水仙碱的耐药性均有明显提高(表 1)，转染后 CIK细胞对阿霉素和秋水仙碱的 IC50 分别是转染前 CIK 细胞的 223458 倍和 671135 倍。 5 转染前后 CIK 细胞对 MCF7 肿瘤细胞的杀伤活性比较 效靶细胞比分别为5：1，1：1，1：5 时转染前后 CIK 细胞杀伤活性结果见表 2，转基因后的 CIK 细胞肿瘤细胞杀伤活性没有明显改变(P005) ，说明经过转基因后 CIK 细胞仍然保持了原有的对 MCF7 细胞的杀伤活性。讨 论CIK 是指 PB
22、MNC 在 IFN-，CD 3 单抗，IL-2，IL-1 等细胞因子存在下体外培养获得的具有较强免疫活性的淋巴细胞 4。CIK 细胞具有异质性，是几种细胞的混合群体。其主要细胞成分为 CD3+CD56+ 细胞和 CD4-CD8+ 细胞，体外培养大量扩增 CD3+CD56+ 细胞是 CIK细胞制备方法的主要特点。CD 56+ 细胞由 IL-2 诱导产生， CIK 细胞较强的细胞毒活性主要中华血液学杂志 2003 年 12 月第 24 卷第 12 期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.124与 CD56 的表达有关。CIK 细胞与 LAK 细胞(淋巴细
23、胞因子激活的杀伤细胞)相比具有很多优势 4、5 ：CIK 细胞增殖能力强，易扩增，抗肿瘤活性高，可以用于体外净化骨髓肿瘤细胞。回输体内后，CIK 细胞可继续分裂增殖，无需外源细胞因子维持，其抗肿瘤活性比LAK 细胞更稳定。因此 CIK 细胞在细胞免疫治疗中受到越来越广泛的重视。一般在肿瘤疾病缓解期应用 CIK 细胞治疗，目的是消除微量残留病，减少或防止复发。但是仍然有一些病例在 CIK 输注后即短期复发，需要化疗控制疾病，由于 CIK 细胞对化疗药敏感，体外培养后输注的宝贵的 CIK 细胞尚未发挥作用就可能被化疗药物杀灭。我们设想，如果能将mdr1 基因转入 CIK 细胞使其产生多药耐药性，延
24、长 CIK 细胞的寿命，有可能使临床应用化疗的同时可以进行 CIK 细胞治疗。实际上，将外源基因转入 CIK 细胞已有成功的先例，1999 年 Schmidt-Wolf 等 6用电穿孔方法将 IL-2 基因成功转入 CIK 细胞，并将其应用于 I期临床试验。Finke 等 7应用腺病毒增强的 CD3 受体介导的基因转染方法将 IL-7 基因成功转入 CIK 细胞，我们将 mdrl 基因转入 CIK 细胞，观察转基因后的 CIK 细胞是否能够产生多药耐药性，同时观察是否能够保持原有的肿瘤细胞杀伤活性。我们证明利用电穿孔方法可以成功地将 mdrl 基因转入 CIK 细胞，转染后的 CIK 细胞表达
25、 P-gp (阳性率约 2137)，并表现出多药耐药性。转染后 CIK 细胞对阿霉素的耐受性较转染前增强了 223458 倍；对秋水仙碱的耐受性增强了 67 1135 倍。转染前后 CIK 细胞对MCF7 肿瘤细胞的杀伤活性在 3 组不同效靶细胞比的杀伤活性比较中均无改变，说明电穿孔转基因后，CIK 细胞依然保持了原有的杀伤肿瘤细胞的活性。转 mdrl 基因成功诱导 CIK细胞产生多药耐药性并保持肿瘤杀伤活性不变，有可能使得 CIK 细胞免疫治疗和化疗可以同时进行，从而扩大 CIK 细胞治疗的应用范围。当然，临床实际应用转基因 CIK 细胞也还存在着一些问题，CIK 细胞治疗需要足够数量的细胞
26、，电穿孔对 CIK 细胞仍有一定的损伤，需要进一步提高培养效率。此外，基因转染后最佳回输体内的时机，体内转基因 CIK 细胞的转归等，都将有待进一步的深入研究。参考文献1 石永进，虞积仁，岑溪南，等细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的大容量扩增与杀伤活性观察生物医学工程杂志，2001，18：94- 96.2 Mickisch GH，Kossig J，Keilhauer G，et al。 ，Effects of calcium antagonists in multidrug resistant primary renal cell carcinomas. Cancer Res, 1990, 50:
27、 3670-3675.3 石永进，虞积仁，朱平，等细胞因子诱导的杀伤细胞降低乳腺癌耐药细胞系对阿霉素的耐受效应北京大学学报，2001，33： 415-4184 Lu PH，Negrin RSA novel population of expanded human CD3+CD56+ cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiencyJ Immunol，1994，153：1687-1696 5 Linn YC，Lau LC，Hui KMGeneration of cy
28、tokine-induced cells from lleukaemic samples with in vitro cytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blastsBr J Haematol，2002，116：78-866 Schmiclt-Wolf IG， Finke S，Trojaneck B，et a1Phase l clinical study applying autilogous immunological elector cells transfected with the interleukin-2
29、 gene in patients with metastatic renal cancer， colorectal cancer and lymphomaBr J Cancer， 1999，81：1009-1016 7 Finke S，Trojaneck B，Lefterova P，et alIncrease of proliferation rate and enhancement of antitumor cytotoxicity of expanded human CD3+CD56+ immunologic effector cells by receptor- mediated transfection with interleukin-7 geneGene Ther ，1998，5：31-39中华血液学杂志 2003 年 12 月第 24 卷第 12 期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.125(收稿日期：2003-0117)(校刘：徐丽娟)
