1、牛奶中酪蛋白和乳糖的分离王鹏 王浩（武汉大学化学与分子科学学院，湖北，武汉，430072）牛奶是一种营养且易于消化吸收的物质。在婴儿及青少年时期，每天喝一定量的牛奶能促进身体健康成长。牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性把牛奶的 PH 值调到酪蛋白的等电点（PH = 4.8）来沉淀分离酪蛋白。酪蛋白不溶于乙醇，故可用乙醇将其中的脂肪除去。乳糖是哺乳动物乳腺分泌的特有的碳水化合物，在牛乳中含量为 47，占干物质的 3839。乳糖在乳中全部呈溶解状态存在
2、。乳糖在乳中存在三种型态：-乳糖、-乳糖和少量醛型乳糖。另外，乳糖不溶于乙醇，所以当乙醇混入水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。一. 材料与方法1. 实验仪器：烧杯（250、100、50 ml） ；HH-6 数显恒温水浴锅；DYY型稳压电泳仪；简易抽滤装置；精密 PH 试纸；抽滤瓶；布氏漏斗；锥形瓶；数字旋光仪；蒸发皿；2. 实验药品及材料：新鲜牛奶（伊力纯牛奶） ；10HAc 溶液；碳酸钙；95乙醇；乙醚和乙醇的混合液（1：1） ；乙醚；考马斯亮蓝 R 试剂；硫酸铜；氢氧化钠。3. 实验方法：（1）酪蛋白的分离操作 1：取 100ml 新鲜牛奶置于 250 ml 烧杯中，加热至
3、40，在搅拌下慢慢加入10乙酸溶液，使混合物溶液的 PH 值为 4.8，在这过程中不停的搅拌。过滤（在滤液中立即加入适量粉状碳酸钙，并搅拌几分钟，留作下面实验（2）用） 。依次用适量的 95的乙醇，乙醇和乙醚的等体积混合液，乙醚洗涤沉淀 12 次，捣碎固体团块。用布氏漏斗过滤后把固体转移至表面皿上，让乙醚挥发掉，自然干燥，称重得酪蛋白 6.1941 g 。现象 1：温水浴条件下加入 HAc 溶液，有小块状沉淀产生，搅拌后变成小颗粒状。过滤速度极慢，花了 4 个小时也没有抽干水。加入乙醇及其它洗液，速度也很慢。最终的白色固体，放置一周后，颜色变成黄色，且成块状；另外，所得滤液浑浊。操作 2：取
4、20ml 新鲜牛奶置于 50 ml 烧杯中，加热至 46.5，在搅拌下慢慢加入10乙酸溶液，使混合物溶液的 PH 值为 4.4。当出现块状沉淀时，停止搅拌，静置，过滤（在滤液中立即加入适量粉状碳酸钙，并搅拌几分钟，留作下面实验（2）用） 。依次用适量的 95的乙醇，乙醇和乙醚的等体积混合液，乙醚洗涤沉淀 12 次，捣碎固体团块。用布氏漏斗过滤后把固体转移至表面皿上，让乙醚挥发掉，自然干燥，称重得酪蛋白 1.3641 g现象 2： 和上次相比，过滤速度明显加快，只用了十几分钟就过滤完成。而且，滤液澄清。同样，酪蛋白放置一周后，颜色变成黄色。（2）乳糖的分离操作：把实验（1）中已经加入碳酸钙的两份
5、滤液，分别用蒸汽浴，使水挥发至液体15mL 和 3ml，分别加入 90ml 和 18ml 无水乙醇，加热并搅拌使其混合均匀，将热的混合物用布氏漏斗过滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙。把滤液转移至锥形瓶中盖上塞子，放置 l2 天，让乳糖充分结晶，过滤，分离出乳糖晶体，待其干燥后，称重。现象：第一份结晶的白色晶体，但产量偏少，只有 0.8558 g。第二份未得到晶体，原因不清楚。（3）酪蛋白的鉴定将少量酪蛋白溶解于水中，进行下列反应：（a） 缩二脲反应：取少量酪蛋白酪于试管，加适量水使酪蛋白溶解，再向溶液中加入氨水和稀硫酸铜溶液，显紫色。（b） 蛋白质反应：取少量酪蛋白酪于试管，加入 2ml 水，
6、再加入 0.5ml 硝酸，振荡，加热煮沸，溶液和沉淀都变成黄色。冷却后，加入过量氨水，溶液变成棕色，再加入 HAc溶液，又变成黄色。（4）乳糖的变旋光测定操作：精确称取 1.25 克乳糖，快速配成 25ml 水溶液，装入旋光管，迅速测定其旋光度，每隔一分钟测一次。10 分钟后，每隔 2 分钟测一次，至 20 分钟为止，记录旋光度的数据。在乳糖水溶液中加入 2 滴氨水，摇匀，静置 202 分钟后测其旋光度，计算比旋光度。现象：由于乳糖的产量很少，只有 0.8558g，就先用 15ml 水溶解，结果基本上不溶，又加入 5ml 水，还有很多固体不溶，再加入 5ml 水，仍有少许不溶物，便拿去过滤，用
7、滤液做旋光测定，在这之前已经用时 25 分钟（即从加水到开始测量的时间） ，测量过程中发现读数只有最后一位小数在变（见表 1） 。由于读数变化不大，只读了 16 个数据。再测加了氨水的乳糖的旋光度，读数为 1.005。然后，又拿了纯乳糖做了上述实验，出现的情况与制备的乳糖一样，读数刚开始变化也没有规律（见表 2） ，再测加了氨水的乳糖，读数为5.080 。表 11.200 1.200 1.325 1.400 1.355 1.4051.405 1.405 1.410 1.400 1.400 1.375表 28.165 8.290 8.270 8.275 8.275 8.195 8.190 8.1
8、908.190 8.085 8.085 7.990 7.960 7.925 7.865 7.635（5）酪蛋白的电泳试验操作：在纸的中心划一个点的一条横线，并在纸两端注明正负极，将纸两端浸入水中，当液面上升到距离中心 1cm 时，用事先准备好的酪蛋白溶液在中心点一点，放入电泳仪中，调节电流使每张纸分到的电流为 3mA，电压为 160V，盖上盖子。40 分钟后，取出纸片，用电吹风吹干纸片，用显色剂考马斯亮蓝 R 试剂显色。现象：纸片上的横线周围有黄色出现，显色后，点了酪蛋白的地方呈粉红色，纸片为蓝色，但没有观测到其他现象。所以，可认为这次实验失败。二 结果与讨论1 . 酪蛋白在牛奶中的存在形式酪
9、蛋白的等电点为 4.8，牛奶的 PH 值为 6.6，因此酪蛋白在牛奶中主要是以负电荷的形式存在。在牛奶中加入酸，当达到其等电点时，酪蛋白便以沉淀析出，而钙仍以离于形式留在溶液中：Ca2+酪蛋白 H + 酪蛋白 Ca2+2 . 本实验应采用新鲜牛奶本实验所用牛奶应为新鲜牛奶，效果最佳。若让牛奶在室温任意放置，牛奶就会变酸。牛奶中存在着多种细菌，特别是乳酸杆菌。这些细菌与牛奶中的乳糖作用生成有酸味的乳酸。实际上乳糖是由一分子一 D 一半乳糖与一分子 D 一葡萄糖以 一 1，4 一苷键连结而成的还原性双糖。牛奶中的微生物把乳糖水解了，而且单从乳糖的丰乳糖部分产生出乳酸：3 . 脂肪对牛奶中酪蛋白和乳
10、糖的分离的影响脂肪也是牛奶的主要成分之一，约占牛奶的 39。在分离酪蛋白时，脂肪会夹杂在酪蛋白中一起沉淀出来。因此在用乙醚洗涤酪蛋白时，应把块状的酷蛋白捣碎，并用搅拌棒搅拌约 10 min，尽可能除去脂肪。4 . 搅拌速度对分离的影响：将牛奶加热时搅拌速度可以快一些，但当滴加 HAc 时，应该先快搅拌，接近等电点时，应慢搅拌，当有块状沉淀产生时，停止搅拌。否则，沉淀变成颗粒状，影响后面的过滤速度。5 . 温度和酸度的影响虽然文献上报道：将牛奶的 pH 值调到 4.8 是最佳的，但实验证明：在温度为 10.。 C左右时，pH 要调得更小4.4 左右。而且，当温度从 35 升到 45和 55时，酪
11、蛋白凝结最大速率分别以 85 * 10 -3 s-1 增加到 177 * 10 -3 s-1，和 189 *10 -3 s-1（参考文献：温度和 PH 值对酪蛋白凝聚的影响 作者：B.Y.KIM ） 。将牛奶加热并加入 10乙酸溶液使酪蛋白沉淀时，注意不要加热过度，也不要加入过多量的乙酸或强酸，因为这些条件会使乳糖水解成葡萄糖和丰乳糖，从而在分离乳糖的实验中导致收得率的降低。6. 碳酸钙的作用使用碳酸钙，主要是中和过剩的乙酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，影响收率。乳糖的结晶在析出乳糖晶体的滤液中，滤液应澄清，否则乳糖很难结晶。如果滤液不澄清，可在过滤前在溶液中加入 1g 助滤剂（如硅藻土） 。如果结晶出未的乳糖有杂色，可用活性炭脱色，再进行重结晶。7.酪蛋白必须是新鲜制备的在实验过程中，可以发现当酪蛋白存放一段时间后，会变黄，而且其表面会析出一层油状液体。8乳糖制备的条件在制备乳糖的过程中，条件控制是需要认真确定的，因为产生的乳糖是微量的，当存在大量溶剂时，会损失掉大量的产品。参考文献：1. 陈忠平： 牛奶中酪蛋自和乳糖的分离 中国期刊网2. B.Y.KIM： 温度和 PH 值对酪蛋白凝聚的影响 中国期刊网3. 童殿荣 ： 旋光仪测定新鲜牛乳中乳糖 中国期刊网4. 武汉大学： 物理化学实验 武汉大学出版社5. 张宗岩： 乳糖的物理特性 中国期刊网
