Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见，先用50氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。 （1） 流速不可太快，切切不可性急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20柱长的增加将极大地改善分离，不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。要集中优势兵力，打击敌人。（3）馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般
