Site-Directed-Mutagenesis基因定点突变step-by-step-protocol6页.doc

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资源描述

Site-Directed Mutagenesis本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术,其它较长片段的突变,删除,插入技术以后会慢慢奉上:在做实验之前,我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做:第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧,Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性差,其错配机率是比较高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果是2000bp的基因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了。第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者改造成不同的亚型,总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要

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