稳定转染细胞系的一般建立方法6页.docx

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资源描述

转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA(通过稳定或永久转染)的细胞系来说,理想的是使用选择标记,通常也是必要的。虽然有许多标记可利用,但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418是一种氨基糖苷类似物,在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH(氨基糖苷类磷酸转移酶)基因将产生G418的解毒作用。这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导,特殊条件由研究者个人决定。1. 建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度(参考建立方法见附录);2. 细胞铺板:转染后24小时将贴壁的细胞传代(传代时,注意通过在显微镜下观察,控制细胞密度,不能使细胞太密集,应该少于生长表面的50%,参考为20%-30%)至15cm培养皿,加入1520ml培养基(DMEM,含血清)进行培养;3. 用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选:铺板完成后,再过24小时,抗性表达,用最佳筛选浓度的G418进行筛选(对于Hela细胞,一般筛选终浓度为800u

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