1、1植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS 2017071 范围本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR 方法。本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。2 原理提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct 值，判定试样中是否含有该源性成分。3 试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB
2、6682的要求。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。3.1 核桃源性成分 Jugr2 基因检测用引物对序列为：核桃5端引物:5-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3核桃3端引物:5-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3核桃探针：5-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-33.2 花生源性成分 Ara b2 基因检测用引物（对）序列为：花生5端引物:5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3花生3端引物:5-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3花生探针：5-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Ecl
3、ipse-33.3 杏仁源性成分 Prudul 基因检测用引物（对）序列为：杏仁5端引物:5-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3杏仁3端引物:5-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3杏仁探针：5-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-33.4 芝麻源性成分 2S albumim mRNA 基因检测用引物（对）序列为：芝麻5端引物:5-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3芝麻3端引物:5-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3芝麻探针：5-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-323.5 榛子源性成分
4、oleosin 基因检测用引物（对）序列为：榛子5端引物:5-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3榛子3端引物:5-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3榛子探针：5-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-33.6 大豆源性成分 Lectin 基因检测用引物（对）序列为：大豆5端引物:5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3大豆3端引物:5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3大豆探针：5-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-33.7 真核生物 18SrRNA 内参照检测用引物（对）序列为：内
5、参照5端引物: 5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3内参照3端引物: 5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3内参照探针：5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-33.8 CTAB 缓冲液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA ，100 mmol/L Tris，用 10%盐酸调节 pH 至 8.0，121高压灭菌 20 min, 备用。3.9 蛋白酶 K：20mg/mL。3.10 苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。3.11 异丙醇。3.1
6、2 70%乙醇。3.13 Taq DNA 聚合酶。3.14 dNTP 混合液。3.15 TE 缓冲液（Tris-HCl 、EDTA 缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0 ）。3.16 10PCR 缓冲液： 200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8 ）。4 仪器和设备4.1 组织研磨器。4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.3 恒温水浴锅。4.4 离心机：离心力 12,000g。4.5 微量移液器（0.5L10L，10L100L，10L200L，100L10
7、00L）。4.6 实时荧光 PCR 仪。4.7 涡旋振荡器。4.8 天平：感量 0.01g。35 分析步骤5.1 试样总 DNA 的提取固体样品：将样品粉碎后称取0.30.6 g，按下列方法提取 DNA。也可用等效商品化DNA 提取试剂盒提取DNA。液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加入1 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下以12,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA 提取试剂盒提取DNA 。（1）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加入600 L CTAB缓冲
8、液和40 L蛋白酶K溶液，振荡混匀，65孵育1 h（过夜孵育更好）, 期间每隔10 min 振荡混匀；（2）加入500 L的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡抽提10 min，室温下以12,500 rpm 离心10 min；（3）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500 rpm 离心10 min；（4）弃去上清液，用65预热的TE缓冲液溶解DNA；（5）小心吸取上清，加入200 L氯仿：异戊醇（24:1 ），振荡抽提，室温下以12500 rpm 离心15 min；（6）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm 离心10 min；（7）弃去上清液
9、，沉淀用70% 乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50LTE 缓冲液中。5.2 DNA 浓度和纯度的测定取 1L DNA 溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量， OD260/280 值应在 1.71.9 之间时，适宜于 PCR 扩增。5.3 实时荧光 PCR 扩增反应体系总体积为25L，其中10PCR缓冲液5L，正反向引物（10mol/L）各1L，探针（10mol/L）1L，dNTPs （ 10mol/L）2L ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 L，DNA模板（10-100ng/L）2L，用灭菌去离子水补足至总体积 25L。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可
10、使用相应的商品化扩增试剂盒。反应参数：50 2min； 95 15min； 95 15s， 60 1min， 40个循环。5.4 实验对照检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。6 结果判断与表述46.1 质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效：(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值35.0；(d)内参对照：有荧光对数增长，且荧光
11、通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0。6.2 结果判定(a)如Ct 值35.0，则判定为被检样品阳性；(b)如Ct值40.0，则判定为被检样品阴性；(c)如35.0Ct 值40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0Ct值40.0，则判定被检样品可疑。6.3 结果表述结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分 ”。结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分 ”。结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑 ”。7 防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院。验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。
