1、禽流感疫苗研究进展摘要 对禽流感的预防，必须在采取严格的生物安全措施的同时，加强必要的免疫措施。对不同类型禽流感疫苗的研究现状、优越性与局限性进行了综述。 关键词 禽流感；疫苗；研究进展 最近，亚洲一些国家不断暴发的禽流感（Avian influenza， AI）事件引起了人们对全球一系列动物和公众健康问题的极大关注，最近的联合国粮农组织（FAO）罗马提交会议指出1，当面临 AI 大流行威胁时，采取大规模扑杀感染动物的措施会丧失很大一部分食物来源，使地方养禽业遭受严重打击，显得不太合理。对禽流感的预防，必须努力集中在采取严格的生物安全措施的同时，加强必要的免疫措施。免疫能减轻临床症状，降低死亡
2、率，减少病毒的扩散和提高群体对感染的抵抗力，从而控制禽流感病毒（Avian influenza vinus，AIV）的广泛传播2。然而，如果疫苗的使用和管理不当，不仅达不到预期的效果，还会污染环境，威胁公众健康。因此，研制安全、高效的 AIV疫苗是专家们为之不懈努力的目标。 理想的疫苗应具有高的生物保护容量，同时消除环境污染和易感动物感染的可能性。总的来说，对于 AIV 疫苗的发展，以下几种设计思路均已被采用或尝试。 1 全病毒灭活疫苗 由于 AIV 基因组的抗原漂移，AIV 疫苗仅能提供 70%的保护力。针对这种特点，AIV 灭活疫苗通常制备成针对几种不同亚型 AIV 的多价疫苗，己证明 1
3、 种灭活疫苗可以至少包括 4 种不同的 AIV 亚型。同只含单一亚型的疫苗比，多价疫苗并没有减弱对同一种 HA 亚型 AIV 攻击的有效保护3，而且各亚型抗原之间不产生免疫干扰。AIV 灭活疫苗能使免疫鸡群在感染 AIV 野毒时有效地减轻损失，并显著减少可能存在于鸡群和环境中的病毒数量，缩短其存活时间，是 AI 防治的主动措施、关键环节和最后防线。而且灭活疫苗具有制备工艺简单、免疫效果确实、免疫持续期长等特点，许多国家已将其作为商品化的 AIV 疫苗应用于家禽中。我国己研制成功不同亚型的 AIV 疫苗，且证明具有良好的免疫保护作用。但灭活苗本身存在一些缺陷4，主要是：影响疫情监测；存在散播病毒
4、的风险；免疫剂量较大，制备成本高。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的粘膜免疫抗体和细胞免疫应答，因而无法有效地抑制呼吸道中 AIV 的复制。近年来，人们试图从技术上突破此缺点，筛选并利用同亚型弱毒疫苗株代替高致病性毒株制备灭活苗，是灭活苗研制中的努力方向之一。例如用 2 种不同的病毒同时感染鸡胚可导致片段间的重排而有可能产生所期望的疫苗株，这些疫苗种子株获得了抗原相关毒株相应的 HA 和 NA 基因，和 A/Puerto Rico/8/34（H1N1）中的6 个基因片段5。这些 PR/8/34 的片段赋予病毒弱毒所以能在鸡胚中迅速生长，适合作为灭活疫苗的生产。 2 基因工程亚单位疫苗 亚单位疫
5、苗是提取 AIV 具有免疫原性的抗原蛋白，加入佐剂而制成。这种疫苗安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力，只是抗体持续时间短，且成本高。谢快乐等曾用台湾 AIV 分离株（H8N4）的 HA 和 NP 制备了复合亚单位疫苗，同时制备了灭活的油佐剂疫苗。当以疫苗诱生的HI 抗体作为评价标准时，发现 2 种疫苗的差别不明显，只是在加强免疫后，亚单位疫苗的 HI 抗体水平的升高比油佐剂疫苗明显6。随着基因工程技术的不断发展，将免疫原性基因导入表达载体，经诱导可获得大量表达的免疫原性蛋白，提取所表达的特定多肽，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗，这样可大大降低疫苗的成本。Kodihalli 等研制了火鸡 H
6、5N2 病毒 NP/HA 和 ISCOM 的复合亚单位疫苗，用其免疫火鸡，21d 可产生较高的抗体滴度，并且 T、B 淋巴细胞被激活，可以对同源和异源（H6N1）亚型病毒的攻击产生保护作用，在攻毒后 3d，可清除火鸡肺部和泄殖腔的病毒7。另外，将 AIV 的基因插入杆状病毒表达载体，利用重组病毒在昆虫细胞中表达的 AIV 蛋白来制备 AIV 的亚单位疫苗也已研究成功。Crawford 等利用杆状病毒表达系统生产 H5、H7 亚型 AIV 的重组 HA 佐剂疫苗，免疫 3周龄白色 Rock 鸡，用同亚型 HPAIV 攻击，结果重组 HA佐剂疫苗组所有的鸡只均不发病，而未免疫组鸡只全部死亡，且经
7、H5 亚型病毒的重组亚单位疫苗免疫过的鸡攻毒后都不排毒8。 基因工程亚单位疫苗产生的抗体不针对病毒的内部蛋白，因此不会干扰 AIV 的血清学调查，而且其不存在毒力返强、散毒和环境污染的问题，是安全性很好的疫苗。重组杆状病毒表达的 HA 亚单位疫苗在禽类表现出良好的免疫原性，免疫后只诱导 HA 特异性抗体应答，不影响疫情监测，显示出了一定的应用前景。 3 重组活载体疫苗 鸡痘病毒作为禽用疫苗病毒载体，具有外源基因容量大、可对表达的外源蛋白进行正确加工修饰、严格的宿主特异性和生物安全性等优点9-11 ，利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，构建含有免疫原性基因的重组病毒，用此重组病毒作疫
8、苗，可在动物体内复制，并不断地表达出免疫原性蛋白，从而诱导禽类产生针对目标病原的免疫保护力。Webster（1995）和 Swaynes（1997）先后构建了含 A/Ty/Ire/1378/83（H5N8）HA 基因的禽痘病毒重组疫苗，用其免疫仔鸡，用在墨西哥分离的致死性强毒 H5N2 攻击，试验结果证明该苗可对 H5N2 提供0%100%的保护12；冀德君、刘红旗等应用表达 H9 亚型 AIV HA 的重组鸡痘病毒疫苗及其传代后第 20、30 代疫苗免疫 5 日龄无特定病原（SPF）鸡群，攻毒后第 5 天各免疫组排毒的鸡数与对照组相比显著减少13；程坚等用表达H9 亚型 AIV HA 基因的
9、重组鸡痘病毒在 7 日龄 SPF 鸡及含抗 FPV 母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验亦表明，重组鸡痘疫苗能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒，效果与 AIV 全病毒灭活苗相当14。贾立军用构建的表达 H5N1 HA 的重组鸡痘疫苗免疫 SPF 鸡和无母源抗体的商品鸡，免疫鸡可抵抗 H5N1 亚型 HPAIV 的致死性攻击，诱导 95%100% 的免疫保护15 。陈平用构建的高效表达 H9亚型 AIV HA 基因的重组鸡痘病毒颈部皮下免疫 1 日龄 SPF鸡，攻毒后试验结果表明，rFPV-Ps-HA 明显抑制了病毒的排出16。以上试验均表明，携带 AIV HA 基因的重组鸡痘疫苗具有良好
10、的效果。 同灭活苗相比，携带 HA 基因的重组活载体疫苗不仅可提供相当的保护效果，而且具有一些独特的优点：安全性高；可通过刺种和皮下注射接种途径进行免疫，使用方便；免疫应激小；用量少，不需添加佐剂，成本大大降低；而且抗体持续时间长，效果好，用其免疫家禽，既可刺激宿主产生体液免疫，又能刺激宿主产生细胞免疫17。基因重组的鸡痘疫苗的最大优点是不干扰血清学调查，因此该重组疫苗适用于监测野毒感染4。 4DNA 疫苗 Ulmer 等18报道了小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的重组质粒后，不仅产生抗 NP 的特异性IgG 抗体，而且诱导 CTL 反应，可有效地保护小鼠抗不同亚型分离时间相隔
11、34a 的流感病毒的攻击。Pertmer 发现，流感病毒 NP 基因的核酸疫苗激活机体的免疫反应不受母源抗体的干扰19。同样，在有母源抗体存在的情况下，HA和 NP 基因均能有效激活细胞免疫应答反应。我国研制的H7 亚型 HA 基因 DNA 疫苗，在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源 MPAIV 在机体内的感染和排毒 20。大量的动物试验都说明在合适的条件下，DNA 接种后既能产生细胞免疫又能产生体液免疫21-24，于是，DNA 疫苗技术应运而生，并逐渐显示出它作为第 3代疫苗的优越性。与传统疫苗相比 DNA 疫苗有许多优点：能长时间表达抗原；具有与天然抗原相同的构象和免
12、疫原性，可同时激发机体产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答，而且不受母源抗体的干扰；结构简单，制备方便；稳定性好，易于保存和运输；能够克服由于免疫系统发育不完善而导致的免疫力低下的缺陷；可用于制备多价疫苗或联苗。 本文为全文原貌 未安装 PDF 浏览器用户请先下载安装 原版全文 目前，对于 DNA 疫苗存在着安全方面的考虑：质粒 DNA 低水平整合到宿主基因组的潜在危险性；DNA 疫苗载体携带的抗生素基因可能导致的生物学后果；产生针对双链 DNA 的抗体；引起免疫耐受。针对上述四种潜在的危害性，美国 FDA、WHO 及 EU 都对 DNA 疫苗的研制制定了一些指导性规定，为 DNA 疫苗的研究
13、、生产及应用指明了方向。由于 DNA 疫苗代价相对较高，且不适于集约化养殖的群体免疫，因此可考虑改进 DNA 疫苗生产工艺和优化疫苗接种方式来开发出价格低廉、实用化的DNA 疫苗。其中应用减毒胞内菌运送 DNA 疫苗的途径取得了一些令人振奋的结果。已经有了一些比较好的减毒沙门氏菌菌株作为禽类 DNA 疫苗的运送载体的研究报道，张小荣等以减毒沙门氏菌运送 H5 亚型 AIV DNA 疫苗的生物学特性研究表明，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能同时激发细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答25，这类疫苗仍在探讨中，需对这类疫苗进行进一步优化，才能最终筛选出真正适合临床应用的疫苗。 5RNA 复制子疫苗
14、 随着 DNA 疫苗的深入研究，人们担心 DNA 会整合到宿主细胞基因组上，造成致癌隐患。此外，DNA 通过核膜较为困难，限制了其作用的发挥，在一定程度上阻碍了DNA 疫苗的推广应用。于是，人们又设想用 RNA 替代DNA 作基因疫苗，近年来开发的 RNA 复制子载体应运而生。该 RNA 复制子可以不依赖于宿主细胞而自主复制，包含病毒基因组 5和 3末端的顺式作用元件、全部非结构蛋白基因编码区（包括复制酶编码基因） ，而结构蛋白基因被缺失，由外源基因取代，这种重组病毒粒子可以很容易地携带达 3kb 的外源 RNA，并且感染的细胞谱较广，包括非分裂细胞26。Vignuzzi 等27将 A 型流感
15、病毒A/PR/8/34（ma ）株的 NP 基因插入塞姆利基森林病毒（SFV ）载体上构建 RNA 疫苗，78 周龄的 C57BL/6 老鼠肌肉注射 10g SFV RNA，34 周后再加强 1 次，共免疫3 次。第 3 次免疫后 13 周，由鼻腔攻入 100pfu 的A/PR/8/34（ma ）病毒。试验结果不仅有较高的中和抗体出现，而且诱导了有效的 CTL 反应，试验小鼠能有效清除肺部的病毒。大量的研究证实 DNA/RNA 复制子比常规 DNA疫苗的免疫原性好28，可以产生更强的抗体应答和更多的CTL 前体，而且使用比常规 DNA 疫苗免疫剂量低 100 倍的复制子疫苗就可以产生与常规 D
16、NA 疫苗相当的免疫效力。可见，RNA 复制子载体的特点包括：复制效率高，用量远远低于常规 DNA 疫苗；可同时诱导抗体应答和 CTL 应答；安全性好，RNA 复制子在胞浆内复制，避免了核的参与，不存在整合进宿主基因组的可能性；RNA 复制子导致转染细胞的溶解，避免了有自主复制能力的病毒的产生；复制子系统能自主复制，可针对多种病原进行连续免疫，而不受己有载体病毒抗体的干扰。 6 冷适应流感弱毒疫苗 用野毒株感染鸡胚在较低温度下（2530）培养，连续传代后可较快的使病毒的致病力减弱，从而获得冷适应流感弱毒病毒供体。通过在表达靶 HA 和 NA 的野生型病毒和病毒供体如 A/Ann Arbor/6
17、/60（H2N2）之间的基因重排可以获得减毒的冷适应性病毒株，病毒的这些特征与多基因的突变有关。滴鼻免疫减毒的冷适应性的流感活疫苗，能引起全身和局部粘膜的免疫反应，显示出保护效力29。这些活的减毒病毒显示出高水平的表型和基因稳定性，不会转变成接近的相关血清学阴性毒株。已经获得 H5N1 和H9N2/Ann 供体的重组冷适应性病毒。这些病毒不会对哺乳动物和鸡致病30。虽然现在流行的肌注禽流感疫苗能够有效地诱导相关病毒特异的血清血凝抑制 IgG 抗体，他们却不能刺激鼻腔产生分泌型 IgA 抗体31。因为分泌型 IgA 能与异源型的流感毒株交叉反应，活的减毒的禽流感疫苗能够广泛地提供针对抗原变异株的交叉保护，一旦新的流感毒株流行时它将非常有用32，33。美国对冷适应流感弱毒疫苗的研制己有 30 多年的历史，但由于担心其安全性，至今仍未被批准使用。俄罗斯是目前全球唯一人流感冷适应流感弱毒疫苗获准使用的国家，该疫苗己在数亿儿童中使用，证实能提供良好的保护，并无不良反应。到目前为止，无论俄罗斯还是全球，没有流感病毒扩散的迹象34，35，但活的 AIV 疫苗病毒仍有与人类共感染毒株发生基因重组，或毒力返强，造成新的流感毒株出现的可能，对其大面积的推广使用，还需在生物安全性方面加以时间上的验证。 7 复制缺陷型流感病毒疫苗
