1、1碱性蛋白酶和亚硫酸钠水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究严 梅 荣摘 要 本文研究碱性蛋白酶 Alcalase 直接水解菜籽粕制取菜籽多肽，试验反应时添加亚硫酸钠的影响及使用膜分离技术去除产物中的硫代葡萄糖苷。结果表明， Na2SO3通过对蛋白质分子中的二硫键的断裂作用及对碱性蛋白酶抑制剂的影响，可提高碱性蛋白酶的活性，使得到的菜籽多肽的分子质量分布发生变化，小分子的多肽比例相应增加。 结果同时显示，膜分离可有效减少或除去硫代葡萄糖苷等抗营养因子，使用截留分子质量 3000 u 的膜对菜籽粕酶解产物进行超滤和透析过滤，当超 滤浓缩因子和透析 过滤体积倍数均为 2 时， 产物的硫代葡萄糖苷含量从 1.
2、36 mg/g 降低到 0.39 mg/g。关键词 菜籽 亚硫酸钠 蛋白质水解 水解度 中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1003-0174（ ）- - 随着世界人口增长和食物来源减少促使人们研究开发新的植物蛋白资源，其中对于油籽食用蛋白的开发已引起人们越来越大的兴趣。菜籽是重要油料作物，世界年产量已超过4000 万吨，中国、印度和加拿大是主要生产国。菜籽提油后的粕中含有 4050的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸组成平衡，符合 FAO 要求，因此菜籽粕可能成为食用蛋白的合适来源 1,2。由于菜籽粕中还存在硫代葡萄糖苷，植酸和多酚类等有毒和抗营养因子，因此目前主要还是当作饲料或肥料使
3、用，只有尽量降低或除去这些有毒和抗营养物质，才有可能使菜籽粕作为食用蛋白来源。近年来，蛋白水解物被认为是生物活性肽的来源，它们易于被大肠细胞吸收进入血液，产生有益的生物活性。已报道的生物活性肽具有免疫调节、抗菌、抗血栓形成和降血压等生理功能，它们在食品、药物和化妆品工业上的应用已引起人们广泛的兴趣。由于消费者对于动物蛋白的担忧日益增加，因而更偏爱开发植物多肽。酶水解蛋白是目前制取植物多肽的最重要手段，通过水解可以得到分子质量大小不同的肽。传统的制取多肽方法是先通过碱提取酸沉淀法制取分离蛋白，再使用不同的蛋白酶将分离蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分复杂，难溶于水，通常需要使用 pH11 以上的强
4、碱提取，加之菜籽蛋白等电点范围广，提取后加酸调节等电点析出的分离蛋白得率较低。本文研究使用碱性蛋白酶 Alcalase 直接水解菜籽粕制取肽，利用膜分离除去硫苷等有毒物质，同时研究水解时加入低浓度亚硫酸钠对于反应速率的影响。1 材料与方法1.1 材料加拿大菜籽：张家港出入境检验检疫局提供；碱性蛋白酶 Alcalase 2.4 L（活力 2.4 AU/g）：诺维信公司；芥子酶 (100units/g)：Sigma 公司。1.2 试剂及仪器1.2.1 试剂石油醚（3060 ） ，氢氧化钠，盐酸，磷酸，柠檬酸，二氯甲烷，氨水，亚硫酸钠等：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。1.2.2 仪器2J
5、LGJ45 检验砻谷机：浙江黄岩粮仪厂；LXJ-离心沉淀机：上海医用仪器厂；PHS-3精密 pH 计：上海雷磁仪器厂；HH-20 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SHA-C 恒温振荡器：常州国华电器有限公司；旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂；L-117 实验室喷雾干燥机：京来亨科贸有限责任公司； AKTAPpurifier 蛋白纯化仪: GE Healthcare Bio-Science AB 公司；752 紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。 1.3 实验方法1.3.1 菜籽脱壳菜籽在砻谷机中碾压后风扬去掉皮层，粉碎，待提取油脂。1.3.2 菜籽脱油使用自制索氏提油装置提取菜籽
6、油脂，该装置结构和原理与市售测定含油量用索氏抽提器相同，但进行了相应放大，每次提油的脱壳菜籽量为 250 g。使用石油醚经 12 h 抽提脱去油脂，室温晾干除去溶剂得到菜籽粕，粉碎过 80 目筛后备用。1.3.3 菜籽粕的主要组分测定水分含量的测定 GB5497-85(105 0C 恒重法)含油量的测定 GB5512-85蛋白质含量的测定 GB5511-85 灰分含量的测定 GB5505-851.3.4 硫代葡萄糖苷的测定方法按 Watter 等 3的方法测定。准确称取样品 0.1 g 于 10 ml 磨口试管中，加入 3 mg 芥子酶，1 mL pH7 的磷酸柠檬酸缓冲溶液和 2.5 mL
7、二氯甲烷，盖塞后室温振荡 2 h 进行酶解反应。将反应液以 3000 r/min 离心 20 min。移取 50 L 二氯甲烷吸收液加入到 3 mL 20%氨水乙醇溶液中，50 0C 恒温水浴反应 2 h，反应结束后冷却，以 50 L 二氯甲烷加 3 mL20%氨水乙醇溶液作空白，测定异硫氰酸酯（ITC）在 235 nm、245 nm 和 255 nm 波长处的吸光度。用 3 mL 95%乙醇代替 20%氨水乙醇溶液按上法操作，并以 50 L 二氯甲烷加 3 mL 95%乙醇作空白，测定恶唑烷硫酮（OZT）的吸光度。按下列公式计算硫 苷含量：OD245 校 =OD245-(OD235+OD25
8、5)/2OZT（mg/g）= OD 245 校 22.1ITC（mg/g）= OD 245 校 28.55硫苷（mg/g） OZT + ITC1.3.5 菜籽粕的酶水解将菜籽粕和 0.25%亚硫酸钠水溶液加入到反应容器中，置于水浴加热至 50 ，用 4 mol/L NaOH 调节 pH 至 8.0，再加入碱性蛋白酶 Alcalase 于搅拌下水解，水解参数为：基质浓度 5（w/v） ，酶与基质比 3，pH 8.0,反应温度 50 。反应过程中加入 4 mol/L的 NaOH 维持 pH 值恒定。反应 120 min 后用盐酸调节反应物 pH 至 4.3，并于 50 维持30 min 灭酶。将水
9、解混合物以 4000g 离心 20 min 除去不溶物,得到上层清液。取样用凯氏定氮法测定上层清液的蛋白含量，计算蛋白提取率。将上层清液分为两部分，一部分直接喷雾干燥得到水解物 P1，另一部分留待膜分离。喷雾干燥时热空气的进口温度为 180 0C, 出口温度为 85 0C。另用水代替 0.25%亚硫酸钠水溶液按上法进行酶水解，水解后进3行喷雾干燥，得到的水解物作为不加亚硫酸钠的菜籽蛋白酶水解对照物 P2。1.3.6 菜籽蛋白水解液的膜分离上述酶水解时留存的部分水解液使用截留分子质量为 3000 u 的膜进行超滤，以除去亚硫酸钠、无机盐和硫苷等有毒和抗营养物质。膜面积为 0.1 M2，超滤液的温
10、度为 40 0C，超滤浓缩因子为 2，超滤后再进行透析过滤(diafiltration)，透析过滤体积倍数为 2。最后将膜上溶液进行喷雾干燥，得到经超滤的蛋白水解物 PF1。1.3.7 水解度的测定方法蛋白质的水解度（DH）是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：DH% = (h/htot) 100式中 h 是每克蛋白中被水解的肽键的毫摩尔数，htot 则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数。本实验采用 pH-stat 法测定水解过程中的水解度（DH） 4，即根据水解过程中为保持反应液 pH 值不变而加入的 NaOH 的量按下式计算水解度：式中 B 为保持 pH 不变而加入的 NaOH 体
11、积（mL） ，Nb 为 NaOH 的浓度，Mp 为蛋白质的量（g） ， 为水解时 -NH 2 的平均离解度。1.3.8 凝胶层析测定菜籽肽的分子质量分布菜籽肽的分子质量分布采用凝胶层析法测定，所用的凝胶柱为 Superose 12 10/300GL(10300mm,GE Healthcare Bio-Science Co.,Piscataway,NJ,USA),使用紫外检测器于 215 nm 检测。洗脱液为 pH 等于 7 的 0.15 mol/L NaCl 的 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液,样品液先经 0.45 M 膜过滤，进样量为 500 L,洗脱液流速为 0.8 ml/min。取牛血
12、清蛋白（67000 u） 、细胞色素（12700 u） 、VB 12(1355 u)和氧化型谷胱甘肽（612 u）为分子质量标准。2 结果与讨论2.1 膜分离清除菜籽水解物中的硫苷加拿大菜籽粕的主要组分见表 1，其蛋白质含量较高，值得进一步开发利用。表 1 加拿大菜籽粕的主要组分的含量/含水率 含油率 蛋白质含量 灰分含量9.20 5.64 45.04 6.78加拿大菜籽粕的硫代葡萄糖苷含量见表 2。硫苷是菜籽粕中影响最大的有害物质，在芥子酶作用下水解可生成异硫氰酸酯和恶唑烷硫酮等有毒物质 5，这些有毒物质的存在使菜籽粕即使用作饲料也受到限制，只有尽量降低或除去硫苷才能有效利用菜籽粕及其蛋白。
13、表 2 显示经过 Alcalase 水解得到的水解物中的硫苷含量大于菜籽粕，说明硫苷易溶于水，在酶水解时被提取到水解液中，使得菜籽蛋白水解物 P1 中的硫苷含量增加。硫苷的增加将严重影响蛋白水解物的应用。表 2 同时显示了膜分离对于硫苷的去除作用。虽然本实验膜分离的超滤浓缩因子和透析过滤体积倍数都不大，但去除硫苷的效果还是明显的，膜分离后硫苷的含量降到未经膜分离处理的 28.7%。如果提高超滤浓缩因子和透析过滤体积倍数，DH(%) =B NbMP11hto04应能进一步减少水解物的硫苷含量。表 2 膜分离对菜籽蛋白水解物中的硫苷含量的影响/ mg/gOZT ITC 硫苷菜籽粕 0.45 0.5
14、8 1.03P1 0.68 0.68 1.36PF1 0.12 0.27 0.392.2 亚硫酸钠对 Alcalase 水解菜籽粕的速率的影响图 1 显示 Alcalase 水解菜籽粕时添加亚硫酸钠对反应速率的影响。从图 1 可知，不管是否添加 Na2SO3，碱性蛋白酶水解菜籽蛋白在前 30 min 的水解速度最快，之后的速度渐趋平稳。而添加亚硫酸钠的水解速度明显大于不添加的反应，且主要体现在前 30 min 水解时两者的速度差别较大，之后的 90 min 时间里两者的水解速度差别较小，水解 120 min 时加与不加亚硫酸钠的水解度分别为 12.1%和 7.7%,前者是后者的 1.6 倍。G
15、uerard 等认为酶水解反应速度随时间减小是由于以下几个因素引起的 6：（1） 基质分子中可被酶水解的肽键的浓度逐渐减少；（2） 存在酶抑制酶，它们在水解过程中不断溶解；（3） 水解过程中酶的失活，这是由于酶受热不稳定性以及酶本身被水解的可能性造成的。亚硫酸钠作为一种还原剂能断裂蛋白质分子间和分子内的二硫键，亚硫酸钠本身也容易通过超滤等方法除去，因此低浓度的亚硫酸钠常用于断裂食品蛋白中的二硫键 7，8 。Hamada 报道添加 0.005 M 亚硫酸钠可增加碱性蛋白酶 Optimase 的活性，提高其水解米糠蛋白的速度 9。Vioque 等研究菜籽分离蛋白中存在的碱性蛋白酶 Alcalase
16、 的抑制剂 10，发现这些物质的分子质量约为 18000 u，与菜籽分离蛋白相比，其组成中的含硫氨基酸的含量较高，达到8.8%, 其中半胱氨酸的含量是菜籽分离蛋白的 3 倍以上，蛋氨酸的含量是后者的 2 倍以上，而菜籽分离蛋白的含硫氨基酸含量仅为 3.3%。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究结果表明碱性蛋白酶抑制剂分子中存在二硫键将含硫单元连接起来，这些二硫键可防止抑制剂被蛋白酶水解 11。本实验中添加亚硫酸钠的水解速度明显大于不添加的反应，可能由于亚硫酸钠断裂二硫键的作用，破坏了菜籽蛋白中存在的碱性蛋白酶抑制剂分子,使之失去对于碱性蛋白酶活性的抑制作用；同时，亚硫酸钠断裂菜籽蛋白二硫键，使得断
17、裂后的菜籽蛋白分子更容易与蛋白酶接触，有利于两者相互作用，从而提高酶水解速率。5024681012140 20 40 60 80 100 120 140水 解 时 间 (min)DH(%)未 加 亚 硫 酸 钠加 亚 硫 酸 钠图 1 亚硫酸钠对 Alcalase 水解菜籽粕的速率的影响2.3 亚硫酸钠对水解物颜色和提取率的影响表 3 列出了添加和不添加亚硫酸钠得到的菜籽蛋白酶解物的颜色和提取率。表 3 亚硫酸钠对菜籽粕水解物颜色和蛋白提取率的影响颜色 蛋白提取率/P1 黄色 61.8P2 黄棕色 54.8表 3 显示水解时添加亚硫酸钠的水解物的颜色较浅。菜籽粕中含有酚类化合物，可在水解和干燥
18、时氧化，使水解物颜色有所加深。亚硫酸钠是一种还原剂，可减少酚类化合物氧化。从表 3 可知，水解时添加亚硫酸钠可提高水解物的蛋白提取率，这可能也是由于添加亚硫酸钠提高了菜籽蛋白的水解度，使得水解物分子变小，水溶性增加的缘故。2.4 凝胶层析结果分析添加和不添加亚硫酸钠的菜籽蛋白水解物的凝胶层析结果见图 2 和图 3。比较两图可知，未添加亚硫酸钠的水解物在凝胶柱中先流出的组分含量较高，按照凝胶层析分离原理，这部分组分的分子质量较大，意味着未添加亚硫酸钠的水解物中蛋白质和大分子肽的数量大于添加亚硫酸钠的水解物。图 2 中 10000 u 以上的峰面积占 33.5%，而图 3 中 10000 u 以上
19、的峰面积仅占 7.8%。上述结果和图 1 所示的水解结果是一致的，即亚硫酸钠能够提高Alcalase 水解菜籽蛋白的速率和水解度。600.20.40.60.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.030001000500010000500001.01.2洗脱体积/mL0.8吸光度图 2 不添加亚硫酸钠的菜籽蛋白水解物的凝胶层析图注：图中数据为分子质量吸光度00.51.01.52.00.0 5.0 10.015.020.025.030.050001000300050000 10000洗脱体积/mL图 3 添加亚硫酸钠的菜籽蛋白水解物的凝胶层析图注：图中数据为分子质量3 结论（1
20、）用碱性蛋白酶 alcalase 水解菜籽粕制取多肽时，可使用膜分离有效除去硫苷等有害物质。（2）菜籽粕水解时添加低浓度亚硫酸钠可明显增加酶水解速率，提高蛋白提取率，同时水解物颜色较浅。（3）凝胶层析显示 alcalase 水解菜籽粕制取多肽时添加亚硫酸钠可减少大分子多肽的比例。Study on Preparation of Peptides by Hydrolysis of Rapeseed Meal with Alcalase in the Presence of Sodium SulfiteAbstract Peptides were prepared directly by hydro
21、lysis of rapeseed meal with Alcalase. Effects of sodium sulfite on proteolysis and separation of glucosinolate by membrane processing were investigated. Results indicate that sodium sulfite can increase the activity of Alcalase and change 7the molecular weight distribution of hydrolysates with more
22、proportion of smaller peptides by disulfide bond cleavage in protein molecules and by possible impact on Alcalase inhibitors. Results also show that glucosinolate can be reduced or eliminated by membrane processing. When hydrolysate of rapeseed meal was ultrafiltrated and diafiltrated with a membran
23、e of 3 kilodaltons molecular weight cut-off and with both the concentration factor of ultrafiltration and the diavolume of diafiltration of 2, the glucosinolate content of the retentate was decreased to 0.39 mg/g from 1.36 mg/g in the hydrolysate. Key words rapeseed, sodium sulfite, proteolysis, deg
24、ree of hydrolysis参 考 文 献1 Pastuszewska B, Jablecki G, Swiech E, et al. Nutritional value of rapeseed meal containing lecithin gums precipitated with citric acidJ. Animal Feed Science and Technology, 2000, 86:1171232 Finlayson A J. The seed protein contents of some cruciferae, in The biology and chem
25、istry of the cruciferaeM. London: Academic Press, 1976 3 Watter L R, Youngs C G. A thiourea-UV assay for total glucosinolate content in rapeseed mealsJ. Journal of the American Oil Chemists Society, 1976, 53:162-1644 Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteinsM. London and New York: Elsevi
26、er Applied Science Publishers, 1986:122-1235 VanEtten C H, Daxenbichler M E, Wolff I A. Natural glucosinolates in foods and feedsJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1969, 17:4836 Guerard F, Guimas L, Binet A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparati
27、onJ. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002, 1920, 4894987 Circle S J, Meyer E W, Whitrney R W. Rheology of soy protein dispersions, Effect of heat and other factors on gelatinJ. Cereal Chemistry, 1964, 41:157-1728 Kella N K D, Yang S T, Kinsella J E. Effect of disulfide bond cleavage on
28、structural and interfacial properties of whey proteinsJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1989, 37: 1203-12109 Hamada J S. Use of proteases to enhance solubilization of rice bran proteinsJ. Journal of Food Biochemistry, 1999, 23:307-32110 Vioque J R, Sanchez-Vioque, Clemente A, et al. Alcalase rapeseed inhibitors: Purification and partial characterizationJ. Journal of Enzyme Inhibition, 2001, 16: 81-8711 Richardson M. Methods in Plant BiochemistryM. Vol.5. New York: Academic Press, 1991.
