1、1中药胃肠舒对糖尿病大鼠胃窦平滑肌细胞线粒体的影响 1宋晓冬 张瑾锦 刘文波 王秀文滨州医学院实验中心，山东，烟台，264003摘要 目的：研究中药胃肠舒对糖尿病（diabetes mellitus, DM）大鼠胃窦平滑肌细胞线粒体形态、结构、功能和蛋白的影响，探讨胃肠舒促胃肠运动的线粒体动能调控机制。方法：选择体重 150-170g 的标准 SD 大鼠随机分为 4 组：正常对照组、DM 组、DM+胃肠舒组、DM+胃肠舒组。透射电子显微镜检测线粒体形态、结构的变化，流式细胞术检测线粒体跨膜电位的变化，荧光测定法检测线粒体呼吸链的变化，Western Blot 检测线粒体蛋白的变化。结果：胃肠舒
2、能改善 DM 大鼠胃 窦平滑肌细胞线粒体的形态、结构，增强呼吸链功能，线粒体跨膜电位和 ATP 含量增高， 细胞色素C 氧化 酶(cytochrome C oxidase, COX)活性增 强，ROS 释放减少，凋亡蛋白家族 Bcl-2 表达上调，Bax 表达下调。 结论：胃肠舒促胃肠运动可能与改善平滑肌的线粒体动能系统有关。关键词：中药胃肠舒；胃肠运动；线粒体；跨膜电位；呼吸链Effect of Chinese Medicine Weichangshu on Mitochondrial in Diabetic Mellitus Rats Stomach Smooth Mucle CellsS
3、ONG Xiao-dong ZHANG Jin-jin LIU Wen-bo WANG Xiu-wen Experiment Center of Binzhou Medical College, Shangdong, Yantai, 264003【Abstract】Objective To study the mechanism of the chinese medicine Weichangshu on mitochondrial kinetic energy in diabetic mellitus rats stomach by measuring the changes of morp
4、hology, structure, function and protein of mitochondria. Methods: Standard Sprague Dawley rats with a mean weight of 150-170g were randomly divided into 4 groups, 基金项目国家自然科学基金资助项目( NO.30672680，NO.30873263)，烟台市科技攻关项目( NO. 2008162)，大学生科技创新计划（BY2007DKCX10 ）作者简介 宋晓冬（1969-），女（汉族），硕士生导师，副教授，从事方向：药物机理Corre
5、sponding. Tel: 0535-6913074, 15552225077E-mail: 通讯地址山东省烟台市莱山区观海路 346 号，邮编 2640032including a control group, DM model group, DM+ Weichangshugroup, DM+ Weichangshu group. The mitochondrial morphology and structure were detected using transmission electron microscopy. The changes of mitochondrial trans
6、membrane potential, respiratory chain and mitochondrial protein were detected using flow cytometry, fluorescence labeling and Western Blot respectively. Results: Weichangshu could ameliorate the mitochondrial morphology, structure and respiratory chain in diabetic mellitus rats stomach. Mitochondria
7、l transmembrane potential, ATP level and activity of cytochrome C oxidase were increased. The release of ROS was decreased. The expression of Bcl-2 up-regulated and bax down-regulated. Conclusion: Weichangshu could promoted the gastrointestinal motility, which might be related with the regulation of
8、 mitochondrial kinetic energy.【Key words】chinese medicine Weichangshu；gastrointestinal motility；mitochondrial；transmembrane potential；respiratory chain糖尿病是一种代谢失调性内分泌疾病，能引起胃肠动力障碍、高血压、眼病、肾病等多种并 发症，其中胃 肠动力障碍的 发生率高达 25-76%1-2 。胃肠动 力障碍主要表 现为胃肠张力和收 缩力低下、蠕动减慢、排空延迟。从中医学 观点看，胃肠运动与脾胃气机的升降有着直接的相关性,气机升降协调,是胃肠协调
9、运动的前提条件,气机升降失调,是胃肠动力障碍性疾病的主要病机。从现代医学观点看，胃肠运动障碍多由胃肠运动功能失调，能量供 应不足导致胃排空时间延长所致 3-7。本课题组人员研制的中药胃肠舒，主要单味药是大黄、枳壳、甘草。前期体外细胞培养实验证明胃肠舒能显著增高胃肠平滑肌细胞 ATP 的含量，明显加大胃 肠平滑肌细胞的线粒体跨膜电位 8-10。本文选取 SD 大鼠构建 DM 大鼠模型，不同 浓度胃肠舒灌胃后检测 胃肠舒对 DM 大鼠胃窦平滑肌细胞线粒体动能系统的影响，探讨胃肠舒促胃肠运动的机制，为开发中药新药提供科学的实验数据。1 材料与方法1.1 材料 3胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂室提供（
10、鲁药制字 Z 1620030009），每粒含生药 1.5g。 SD 大鼠 ( 体重 150-170g)由烟台绿叶实验动物中心提供。1.2 DM大鼠模型的建立、分组及干预SD大鼠腹腔内注射链尿佐菌素150mg/kg造模 11-12，2周后尾静脉采血测血糖，血糖16.9mmol/L者为DM大鼠模型建立，不符合条件者予以剔除。所有实验大鼠分为正常对照组，DM组，DM+胃肠舒组（75mg/ml）、DM+胃 肠舒组（150mg/ml ），每组10只，胃肠舒干预1w后，禁食24h，处死各组大鼠，取距幽门近端约23cm的胃窦组织。1.3 透射电子显微镜观察线粒体形态结构取胃窦肌层组织清洗后，3%戊二醛固定5
11、h，PBS缓冲液清洗，1%锇酸固定1.5h后，酒精、丙酮梯度脱水，Epon812包埋聚合，半薄切片定位，超薄切片70nm，双氧铀、柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM1400，JAPAN）下观察线粒体形态结构并拍照。1.4 线粒体跨膜电位的检测取胃窦肌层组织PBS 洗涤后剪碎，按照组织线粒体分离试剂盒（碧云天生物科技有限公司）要求分离线粒体后，加入适量线粒体储存液，重悬线粒体，加入终浓度为1ugmL -1 的JC-1荧光探针 ，放入 37C孵箱里静置培养45min。PBS清洗2次并重悬，流式细胞仪(激发波长488nm，发射波长525nm，Beckman Coulter, Inc, America
12、)检测。1.5 ATP定量取胃窦肌层组织置于冰上，PBS洗涤后剪碎，按照ATP试剂盒（碧云天生物科技有限公司）要求，加入1ml ATP检测裂解液后用玻璃匀浆器裂解匀浆后， 4 12000rpm离心10 min，取适量上清放于96孔板后，按照Celltiter-GloTM 试剂盒操作，酶标仪检测（波长562nm）。1.6 细胞色素C氧化酶活性的测定取胃窦肌层组织PBS 洗涤后剪碎，按照组织线粒体分离试剂盒要求分离线粒体后，加入含有蛋白抑制剂的线粒体裂液裂解线粒体,用BCA 法测定蛋白浓度。制作标准曲线,计算每个线粒体样品的蛋白浓度。线粒体细胞色素C氧化 酶能将还原型的细胞色素C转化为氧化型细胞色
13、素C。根据这个原理,向含有还原型细胞色素C的反应体系中加入线粒体样品, 加入样品后0s与 60s分 别用分光光度计比色测OD 值, 0s 与60s差值反应细胞色素C 氧化酶的活性。根据前述测得的线粒体蛋白浓度将细胞色素C氧化酶活性4的单位转化为mol/minmg pro 。1.7 ROS测定取胃窦肌层组织制备单细胞悬液，按照ROS 检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）要求，悬浮于稀释好的DCFH-DA（10umol/L）荧光探针中，流式细胞仪检测。1.7 Western Blot定量 BCL-2和BAX 蛋白表达提取胃窦肌层组织ACTIN、 BCL-2、BAX蛋白，波长595nm 酶标仪上Br
14、adford法检测蛋白浓度。8%分离胶8ml，5%积层胶 4ml灌注SDS-PAGE 凝胶，用微量进样器每孔分别加Marker、蛋白样品ACTIN 和BCL-2、BAX各30ul（约50ug），积层胶电压80v，分离胶电压160v，待溴酚蓝到达底部，关闭电源，把胶移入缓冲液中平衡10min。转膜后放入5%脱脂奶粉、0.03%叠氮钠的TBS中平衡1h。分别加羊抗鼠actin单 克隆抗体（1：500，Santa Craz公司）和兔抗鼠bcl-2、bax多克隆抗体（1：50，购自Santa Craz公司）， 摇床上作用8h。TBST漂洗3次，每次5min。分别加二抗HRP标记的兔抗羊IgG（1：10
15、00，博士德公司）和 HRP标记的羊抗兔IgG （1：1000，博士德公司），摇床上作用2h。ECL荧光显影液加膜上1min ，终止反应，暗室内显影，定影。1.8 统计方法实验数据均采用均数标准差表示,应用SPSS 11. 5 for windows统计软件进行单因素方差分析, P 0. 05为有统计学意义。2 结果2.1 线粒体形态结构的变化透射电子显微镜下观察到正常对照组胃窦平滑肌细胞膜结构完整，胞核呈不规则梭形，线粒体数目繁多，线粒体膜完整，线粒体脊曲折清晰可见，细胞质中尚可见到排列整齐的肌丝、密体等超微结构。DM 组胃窦平滑肌细胞膜模糊，肌丝排列紊乱，密体减少， 线粒体空泡 样变严重，
16、线粒体膜断裂，线粒体脊分辨不清。DM+ 胃肠舒组胃 窦平滑肌细胞线粒体空泡样变减少，能够清晰分辨线粒体脊。DM+ 胃肠 舒组胃窦平滑肌细胞线粒体数目明显增多，线粒体膜较完整。5NMMMMMMMMMMM M MBBBFFNMMMMaMMbNMMMMM MMMMMc6图1 透射电子显微镜下观察线粒体形态结构，a：正常对照组，b：DM组，c：DM+胃肠舒 组，d：DM+胃肠舒 组。M：线粒体，N：细胞核，F：肌丝，B ：密体。Figure 1: Mitochondrial morphology and structure using transmission electron microscopy.
17、 a: normal control group, b: DM group，c: DM+ Weichangshugroup, d：DM+Weichangshu group. M：mitochondrial, N：nucleus, F：filament，B：dense body2.2 线粒体跨膜电位的变化线粒体跨膜电位的存在是线粒体生成ATP的基础条件，跨膜电位的崩溃会导致能量生成障碍，细胞内还原性物质耗尽，线粒体肿胀破裂。流式细胞仪荧光分析图结果显示正常对照组阳性细胞率为98.46%，DM组阳性细胞率为10.10%，胃肠舒干预的两组分别为31.71%和54.66%。阳性细胞的减少预示着线粒体跨
18、膜电位的降低，从结果分析DM组线粒体跨膜电位明显降低，胃肠舒干预组与DM对照组相比跨膜 电位明显增加（p0.05 ）。NMMMMMMM MMMd7图2 线 粒体跨膜电位的变化， a：正常对照组，b：DM 组，c：DM+胃肠舒组，d：DM+胃肠舒组。Figure 2 Change of mitochondrial transmembrane potential. a:normal control group, b: DM model group, c: DM+ Weichangshugroup, d: DM+Weichangshu group2.3 线粒体呼吸链的变化线粒体呼吸链是将底物的电子经
19、过一系列酶系的传递最后生成ATP供给细胞生命活动能量的过程。COX是线粒体内呼吸 链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质,在电子传递过程中一旦有电子漏出会产生ROS。本文 检测结 果显示DM 组大鼠 线粒体呼吸链中ATP含量和COX活性降低，ROS释 放增多，表明 该组大鼠呼吸链功能明显减弱。胃肠舒干预组ATP含量和COX活性有所上升，ROS释放减少，表明胃肠舒改善了DM大鼠线粒体呼吸 链功能。表 1 线粒体呼吸链的变化（xs，n=10， *P0.05）Table 1 change of respiratory chain（xs，n=10，*P0.05）分组 ATP 含量（um
20、ol/g） COX 活性 (umol/min/mg pro.)DCFH-DA 荧光强度（ROS ）正常对照组 10.870.16 3.980.11 5.640.21DM 模型组 3.710.12 1.070.31 21.190.30DM+胃肠舒组 6.810.17* 2.570.23* 12.690.38*DM+胃肠舒组 9.780.14* 2.970.14* 7.610.22*82.4 线粒体蛋白的变化Western Blot结果显示DM组大鼠与正常对照组相比Bcl-2 蛋白表达下调，Bax蛋白上 调。胃肠舒干预组与DM组相比Bcl-2蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调。Image软件测量各条
21、带的灰度，结果具有统计学意义（ P0.05)。图 3 BCL-2 和 BAX 蛋白的变化，1：正常对照组，2：DM 组，3：DM+胃肠舒组，4：DM+胃肠舒组表 2 BCL-2、BAX 蛋白和 ACTIN蛋白条带的灰度比值( s, n=10,P0.05)XTable 2 Grayscale analysis of BCL-2 and BAX protein灰度比值 Control DM DM+胃肠舒组 DM+胃肠舒组BCL-2/ACTIN 3.250.01 1.270.02 2.110.02 3. 020.01BAX/ACTIN 0.040.02 0.900.01 0.490.02 0.270
22、.013讨论诸多研究表明细胞水平能量代谢障碍早于机体器官系统的病理生理改变，是多器官多系统紊乱的根本原因。线粒体作为细胞内氧化磷酸化和形成能量ATP的主要场所，是细胞内的能量转换器，因此改善线粒体能量代谢是促进机体器官系统运动的关键。本文电子透射显微镜观察到正常对照组胃窦平滑肌细胞膜结构完整，胞核梭形，线粒体膜清晰可见，数量丰富，线粒体脊曲折完整、数目较多。 DM组胃 窦平滑肌细胞排列紊乱，细胞内有很多大的空泡，线粒体肿胀破裂，内有空泡样变，线粒体膜不完整，线粒体脊模糊。而不同浓度胃肠舒的干预都能改善线粒体的形态结构，使得线粒体数目增加，结构完整。线粒体的这种变化提示DM 组大鼠平滑肌细胞线粒
23、体形态结构的变化，可能最终导致了细胞能量代谢紊乱，从而造成胃肠运动障碍，改善线粒体形态结构能够提升细胞能量代谢的能力，促进胃肠运动。1 2 3 4ACTINBCL-2BAX9线粒体内外膜完整性的破坏，必然引起跨膜电位的降低，跨膜电位的降低会进一步引起线粒体膜内外一系列的生化改变,如细胞色素氧化酶活性减弱、呼吸链与氧化磷酸化失耦联、ROS 渗漏、凋亡因子 释放、ATP合成停止等 13-15。细胞色素氧化酶是电子传递链的重要环节，传递电子复合物，是线粒体的标志酶，也是线粒体氧化呼吸的限速酶，在细胞的有氧代谢和氧化磷酸化耦联中起关键作用，其结构和活性的改变可影响电子传递链的功能，导致 ATP能量生成
24、障碍。当 线粒体损伤 、细胞色素氧化酶活性降低时ATP 能量代谢发生障碍；而当线粒体修复，细胞色素氧化酶活性恢复后，ATP 能量代谢恢复正常。ATP是机体生命活 动的源泉,细胞的物质代谢、信号转导、电 活动、肌肉收缩等生理过程均需要ATP提供直接的能量来源, ATP产 生不足 势必影响细胞的机能与代谢障碍和结构损伤,从而影响器官功能和整个机体的生命活动能力。本文流式细胞仪检测到DM组线粒体跨膜电位显著降低，细胞色素氧化酶活性减弱，ATP含量减少；胃肠舒干预组能提高线粒体跨膜电位，防止ROS 的渗漏， 细胞色素氧化酶活性增强，促进ATP 的合成。线粒体形态、结构和功能的变化最终会导致蛋白表达的改
25、变，诸多学者研究表明 16-18，糖尿病患者血液中葡萄糖浓度很高，会伴随着凋亡基因蛋白的变化。 Bcl-2是一 类在线粒体水平上决定 细胞存活或死亡的蛋白质家族，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 等，在正常细胞中，这些成员呈现功能适应性的细胞内分布，抗凋亡成员主要定位于线粒体膜内外侧，另外在核膜、内质 网上也有存在， Bax主要位于细胞浆中，但当凋亡发生时，它从胞 浆移到线粒体并与线粒体膜相结合，这两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。本研究结果显示DM组大鼠与正常对照组相比Bcl-2蛋白表达下调，Bax 蛋白上调。胃肠舒干预组与DM组 相比Bcl-2蛋白表达上调
26、，Bax蛋白表达下调。本实验初步阐释了胃肠舒促胃肠运动可能与其改善线粒体的动能系统有关，本实验对于用现代医学观点阐释中药促进胃肠运动的作用机制提供了科学的实验数据，为开发胃肠动力中药新药开辟了思路，奠定了坚实的实验理论基础，意义重大。参考文献(1) F e l dma n M, S c h i l l e r L R . Di s o r d e r s o f gastrointestinal motility associated with diabetes mellitusJ. Ann Intern Med 1983; 98: 378-384.(2)Icks A, Haastert B,
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