平末端加A尾1页.doc

上传人:晟*** 文档编号:6747567 上传时间:2021-09-13 格式:DOC 页数:1 大小:11.50KB
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中山大学的陈家杰对平末端DNA片段加A方法进行了改进。背景:高保真PCR酶利用自身的35外切酶活性(pfu DNA Polymerase,PrimeSTAR HS DNA Polymerase等)能保证PCR产物的保真度,但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段,不能直接TA克隆。因此,平末端DNA片段需要进行加A后方可TA克隆。平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物,加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。步骤较为烦锁,要购买特定的dATP Buffer。方法改进:平末端DNA片段加A方法根据实验者的技能程度推荐两种方法:(1)保守法,先对平末端PCR产物纯化后,浓度要求至少20ng/ ul(大概就好,跑胶图像条带清晰,明亮),取14.5 ul PCR产物,加入2 ul Taq Buffer,3ul dNTP,0.5 ul Taq酶,在72度反应1020min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆,此方法操作容易,成功率高;(2)快速法,高保真酶PCR后的管子

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