1、一种天然的蜗牛驱杀剂佛山市顺德区李兆基中学 高二 4 班 程名峻（本实验已申请发明专利，未经作者本人允许，禁止使用和转发）摘要：目的：用茶籽粉的提取物茶皂素和柚子提取物和酶转化技术制作一种有效的、对环境无破坏的天然蜗牛驱杀剂。 方法：制作四种成分含量不同的蜗牛驱杀剂进行实验并进行效果对比，并依据实验对照原则设立阳性对照组（撒有 500g 6%四聚乙醛的白菜地）和阴性对照组（无作处理的白菜地） 。 结果：发现以 3g 茶籽粉、10g 柚片、70温水 40g、固定化蜗牛酶 0.009g 和磷酸盐缓冲液为原料制得的 pH 为 7.5 的蜗牛驱杀剂效果最好。一、背景及目的：我家楼顶种着一片蔬菜，常常受
2、到蜗牛的侵害，严重时食光叶片造成死苗。曾经尝试使用化学合成杀虫剂，如四聚乙醛，来驱杀蜗牛，有一定的效果，但效果并不理想。且化学合成杀虫剂在土壤中过量残留或者在动植物体内富集会破坏土壤品质、甚至威胁人类健康。茶籽粉是油茶籽经过机械压榨提取油脂之后剩余的工业废弃物。一次用浸泡过茶籽粕的水溶液洗头，不小心让溶液弄到眼睛，眼睛刺痛，却灵感一来，尝试用这些溶液喷杀蜗牛，发现效果显著。探其原因，发现茶籽粉中富含茶皂素（茶皂苷） 、蛋白、多糖等植物成分，其中茶皂素是一类五环三萜皂苷类物质，化学结构式由糖配基和三萜皂苷元配基组成。通过前人研究得，茶皂素具有溶血毒性，能破坏红细胞的细胞膜而使细胞质外渗，导致红细
3、胞解体，可推测浸泡过茶籽粕的水溶液对蜗牛的驱杀作用主要是通过茶皂素的溶血毒型实现的。 关于茶皂素具有驱杀蜗牛的特性未见报道，而人们对绿色蔬菜较为重视。在得到以上启发后，便设计了以“制作一种天然的蜗牛驱杀剂”为目的的实验，然后在他人的指导下在我校校外科研合作基地中科院南海生物医药产业中心制作和改进这种含有茶皂素的蜗牛驱杀剂。二、实验材料与方法1、简单验证茶籽粕浸出溶液的效果方法：对照法实验: 于白菜定植后在蜗牛发生期将 500g 农药（ 6%的四聚乙醛）撒入一定面积的白菜地中，将 2.5L 用 5L 水、250g 茶籽粕经煮沸得到的茶籽粕浸出溶液喷洒在同等面积的白菜地上，且两块白菜地中的蜗牛都为
4、在原菜地中随意选择的 25 只。作物栽培 10 天后统计蜗牛剩余数。 （这两片白菜地已经多次撒下四聚乙醛）药剂项目 6%四聚乙醛 茶籽粕浸出溶液蜗牛总数 25 25蜗牛死亡数 6 7蜗牛逃逸数 8 10由表可得，茶籽粕浸出溶液对蜗牛的驱杀效果比 6%四聚乙醛稍微好一点，但效果不明显。2、制作含茶皂素的蜗牛驱杀剂得到上述结果后，上网查找有关资料并向老师请教其原因，后又向老师推荐的专家请教，得知茶籽粕浸出溶液对蜗牛具有驱杀作用的主要成分为茶皂素，且它的水溶性很高。然后在专家的指导下进行了对茶皂素的提取并对药剂改良以制作一种天然的、便于使用的蜗牛驱杀剂的实验。详细制作如下：（1）实验仪器设备和材料：
5、高效液相色谱仪（HPLC，安捷伦 Agilent 1200） 、万分之一天平（梅特勒Mettler） 、百分之一天平（梅特勒 Mettler） 、茶籽粉、固定化蜗牛酶（Sigma-Aldirich） 、海南柚片、 Na2HPO412H2O、NaH 2PO42H2O、实验用水、量筒、烧杯、刻度吸管、胶头滴管、圆底烧瓶、恒温加热磁力搅拌器、旋转蒸发仪、抽滤装置、滤纸、pH 试纸、玻璃棒、高压蒸汽灭菌锅。（2）药物作用原理与实验原理：茶皂素由糖配基和苷元配基构成，对白细胞无害，但能破坏红血球，具有溶血性，但只有直接接触血液时才起作用，因此对冷血动物就有致命毒性，而对高等动物无毒性 ，因此我们推测茶皂
6、素能驱杀蜗牛的机理就是它的血溶性。 1且茶皂素的水溶性很高，因此本实验用水作溶剂进行提取。蜗牛酶具有很强的水解能力。研究发现，茶皂素的溶血毒性，主要是通过皂甙元来实现的，糖基的水解切除将提高其溶血毒性。因此，用酶催化技术将蜗牛酶和茶皂素混合反应后，会使茶皂素的糖配基和苷元配基分离，而实验表明，分离后的茶皂素对蜗牛的驱杀效果更明显。柚片（柚子皮）中的类黄酮物质具有杀菌、抗病毒作用，且柚片中含有柠檬烯类的挥发性精油，因此具有芳香气味。药剂中加入柚片可以减少蔬菜发病率，且我们推测这些芳香气味能对蜗牛进行气味引诱，并通过类黄酮增强对蜗牛的驱杀效果。（3）制作过程 ： 2 4根据文献和前人的经验制定实验
7、方案，并以此设置四个实验组；配料实验组茶籽粉 柚片 温水 固定化蜗牛酶磷酸盐缓冲液调节的溶液 pH实验组 1 1g 3.6g 50 50mL0.0012g 6.5实验组 2 2g 8g 70 50mL0.004g 7.5实验组 3 3g 10g 7040mL0.009g 7.5实验组 4 3g 10g 7040mL无 7.5实验组 1用天平称取茶籽粉 1g，柚片 3.6g，并将柚片剪碎至指甲大小。将茶籽粉与剪碎后的柚片用 50mL 实验用水 60加热回流提取 5h，提取完后放冷后过滤。在滤液中加入磷酸缓冲液调节酸碱度至 pH6.5，并加入 0.0012g 蜗牛酶，然后60水浴 1h。过滤后浓缩
8、。最后将浓缩液在 120条件下灭菌 5min,，制得第一种蜗牛驱杀剂。实验组 2用天平称取茶籽粉 2g，柚片 8g, 并将柚片剪碎至指甲大小。将茶籽粉与剪碎后的柚片用 50mL 实验用水 70加热回流提取 4h，提取完后放冷后过滤。在滤液中加入磷酸缓冲液调节酸碱度至 pH7.5，并加入 0.004g 蜗牛酶，然后 60反应 1 小时。过滤后浓缩。最后将浓缩液在 120条件下灭菌 5min,，制得第二种蜗牛驱杀剂。实验组 3用天平称取茶籽粉 3g，柚片 8g，并将柚片剪碎至指甲大小。将茶籽粉与剪碎后的柚片用 40mL 实验用水 70加热回流提取 4h，提取完后放冷后过滤。在滤液中加入磷酸缓冲液调
9、节酸碱度至 pH7.5，并加入 0.009g 蜗牛酶，然后 60反应 1 小时。过滤后浓缩。最后将浓缩液在 120条件下灭菌 5min,，制得第三种蜗牛驱杀剂。实验组 4用天平称取茶籽粉 3g，柚片 10g，并将柚片剪碎至指甲大小。将茶籽粉与剪碎后的柚片用 40mL 实验用水 70加热回流提取 4h，提取完后放冷后过滤。在滤液中加入磷酸缓冲液调节酸碱度至 pH7.5，不加蜗牛酶。直接浓缩。最后将浓缩液在 120条件下灭菌 5min,，制得第四种蜗牛驱杀剂。（4）主要药物含量检测用 HPLC 检测得各实验组中的茶皂素和黄酮含量：实验组 1 实验组 2 实验组 3 实验组 4茶皂素 1.32% 2
10、.7% 4.0% 3.9%黄酮 1.18% 2.45% 2.94% 3.12%附图Caption此照片是在本课题组在进行浓缩时拍的一张照片。图中所示物有旋转蒸发仪、抽滤装置。3、药剂效果的对比与验证 3方法：对照法实验：将实验组 14 获得的驱杀水剂稀释成 100 倍液，按大约 50kg/亩，于定植后蜗牛发生期撒入地表，作物栽培 10 天后，进行蜗牛驱杀效果和作物病害情况观察，并与阳性对照组（撒有 500g 6%的四聚乙醛的白菜地）和阴性对照组（只有蜗牛的空白白菜地）对比。 （实验组 14 分别对应实施例 14，实施例5 为阳性对照组，实施例 6 为阴性对照组）试验效果如下：实验组项目 1 2
11、 3 4 6%四聚乙醛颗粒白菜地蜗牛总数 25 25 25 25 25 25蜗牛死亡数 6 7 9 5 10 3蜗牛逃逸数 14 15 15 10 12 2软腐发病率% 9.1 7.5 5.9 10.2 13 12干烧心发病率% 4.1 3.8 3.5 8.9 11.2 10.5附图Caption这组照片是本课题组按正文方法按一定比例将一定量的四种不同的蜗牛驱杀剂和 6%四聚乙醛撒在生菜地上进行实验时的照片。4、对茶籽粉进行成分检测目的：鉴定茶籽粕的安全性。过程：将茶籽粕交给研究机构进行成分鉴定，得出以下报告：检 验 报 告Certificate of AnalysisProduct Name
12、 产品名称 Tea Saponin 茶皂素 提取物Latin Name 拉 丁 名 Camellia seedSource of Extract 提取来源 Camellia seed 籽Analysis Date 检验日期 2017.04.13Certificate Date 报告日期 2017.04.18分析项目 检测标准 检测结果Physicochemical Control 理化项Appearance 性状 Fine powder 精细粉末 Complies 合格Color 颜色 Light brown-yellow 浅棕黄色 Complies 合格Odor Taste 气味 Chara
13、cteristic 特有气味 Complies 合格Loss on Drying 干燥失重 5.0% 1.33%Water insoluble 水不溶物 1.0% 0.8%Residue on Ignition 炽灼残渣 5.0% 1.02%Assay (Tea Saponin, HPLC)含量 35% 38.21%Sieve Analysis 目数 100% pass 80 mesh Complies 合格Density 堆积密度 0.5-0.7g/ml 0.67 g/mlHeavy Metals 重金属 20ppm Complies 合格As 砷 2ppm Complies 合格Pb 铅
14、2ppm Complies 合格Hg 汞 0.2ppm Complies 合格Pesticides 农药残留 20ppm Complies 合格Organochlorine 有机氯类 5ppm Complies 合格Organophosphates 有机磷类 2ppm Complies 合格Pyrethroids 拟除虫菊酯类 2ppm Complies 合格Microbiological Control 微生物Total Plate 细菌总数 1000CFU/g Complies 合格Yeast & Mold 霉菌及酵母菌 100 CFU /g Complies 合格E. Coli 大肠杆菌
15、 Negative 不得检出 Complies 合格Salmonella 沙门氏菌 Negative 不得检出 Complies 合格附图三、分析与结论：1、由于实施例 13 中的茶皂素和柚片内的成分含量提高，药剂对蜗牛的驱杀效果逐渐增强，且白菜的软腐发病率和干烧心发病率逐步降低，可看出此类蜗牛驱杀剂能降低白菜的软腐发病率和干烧心发病率。因此实验组 3 制得的药剂效果最好。2、对比实施例 3 和 4 得，由于缺少蜗牛酶的催化，试验效果比实施例 13的差。3、将实施例 3 与阳性对照组对比，发现实施例 3 的蜗牛存活数（不计逃逸数）比阳性对照组的少，且实施例 3 中白菜的发病率比阳性对照组的低。
16、可见按照方案所用量，实施例 3 的药剂比 6%的四聚乙醛效果好。4、通过对茶籽粕的的成分分析与将成分含量和国家安全标准对比可得，茶籽粕内重金属含量很低且合格，农药残留也很低且合格，且其中的细菌含量合格。因此茶籽粉对环境和人体无害。综上所述，可得以 3g 茶籽粉、10g 柚片、70温水 40g、固定化蜗牛酶0.009g 和磷酸盐缓冲液为原料制得的 pH 为 7.5 的蜗牛驱杀剂效果最好。四、参考文献、 茶皂素的鱼毒活性及其应用的研究 朱全芳 夏春华 出版社茶叶科学 1、 茶籽粕中茶皂素提取的工艺研究 刘锐 出版社湖南工业大学 2、 茶枯液防止蜗牛、蛞蝓效果好 覃启平 出版社湖南农业 3、微球固定化蜗牛酶转化人参皂苷 Rb1 制备人参稀有皂苷 Compound K 研 4究 于兆慧 刘其媛 崔莉 贾晓斌 张振海 金鑫 出版社中草药
