1、HPLC 法测定独一味制剂中山栀苷甲酯的含量何希瑞 1, 2, 李茂星 2, 樊鹏程 2, 尉丽力 1, 2, 张汝学 2, 贾正平 1, 2*(1.兰州大学，兰州 730000；2.兰州军区兰州总医院，兰州 730050)摘 要 目的:建立独一味制剂中山栀苷甲酯的 HPLC 测定方法，为进一步控制独一味制剂的质量提供良好的参考。方法: 采用 HPLC 反向色谱柱 Symmetry C18 (4.6 mm150 mm, 5 m, Waters)，梯度洗脱，09 min 乙腈-水(9: 91)，920 min 乙腈- 水(15: 85)，流速1.0 mLmin-1， 柱温 20 C，检测波长 2
2、35 nm。结果:山栀苷甲酯浓度在 9.6115.2 gmL -1 范围内与峰面积积分值线性关系良好；加样回收率为 97.69 %。从所有的制剂中均检测出山栀苷甲酯，但含量差别较大。结论:本方法准确、简便、专属性强，重现性好，适用于独一味制剂中山栀苷甲酯的含量测定。【关键词】 HPLC；独一味；山栀苷甲酯；含量测定Determination of Shanzhiside methylester in preparations of Lamiophlomis rotata by HPLCHe Xirui1,2, Li Maoxing2, Fan Pengcheng2, Wei Lili2, Zh
3、ang Ruxue2, Jia Zhengping1,2*(1.Lanzhou University, Lanzhou Gansu 730000; 2. Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou Gansu 730050)【Abstract】 Objective: To establish a HPLC method for the determination of Shanzhiside methylester in preparations of Lamiophlomis rotata. Methods: HPLC analysis was perf
4、ormed on Symmetry C18 (5 m) column and gradient elution 0-9 min, acetonitrile-water (9: 91), 9-20 min, acetonitrile-water (15: 85) were used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mlmin-1. The column temperature was 20 C and the detection wavelength was 235 nm. Results: The linear range of Shanzh
5、iside methylester was 9.6-115.2 gml-1 (r=0.999 8) and the average recovery was 97.69 %. Shanzhiside methylester could be detected from all preparations and its content varied grandly. Conclusion: The method is accurate, convenient, specificity and reproducible. It is applied to determine the content
6、 of Shanzhiside methylester in preparations of Lamiophlomis rotata.【Key words:】 HPLC; Preparations; Lamiophlomis Rotata; Shanzhiside methylester; Assaying独一味为唇形科独一味属植物Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudog干燥根及全草，主要分布在甘肃、青海、四川、云南、西藏等地 1。 中国药典先后收载独一味片剂、胶囊剂和原药材。近年来，先后有五十余家单位申报了九十余种各类相关制剂，临床应用广泛。黄酮和环烯醚萜苷是独一
7、味的主要化学成分，药理实验表明，环烯醚萜苷是其止血镇痛活性成分 26 。2010年版中国药典在独一味制剂及原料的质量标准中要求增加8-O- 乙酰山栀苷甲酯和山栀苷甲酯的HPLC含量测定。有关独一味药材及制剂中8-O-乙酰山栀苷甲酯的含量测定已有报道 78 ，本实验首次采用HPLC法对不同厂家独一味制剂中的山栀苷甲酯进行含量测定，为进一步完善独一味的质量标准，保证用药的有效性和安全性提供良好的参考。1 仪器与试药1.1 仪器 高效液相色谱仪（美国 Waters 公司） ，包括 600 型二元梯度泵、996 型二极管阵列紫外检测器，BP210S 电子分析天平（德国 Sartorius 公司） ，S
8、Y-2 电热恒温水浴锅（北京泰克仪器有限公司） ，SK7200H 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司） 。1.2 试药 市售独一味制剂（见表 1） ，山栀苷甲酯对照品(实验室自制，MS, NMR 确定其结构)，纯化水，乙腈为色谱纯 (Caledon Laboratories LTD. Canada)。表 1 市售独一味制剂样品 药品名称 生产厂家 国药准字 生产批号1 独一味颗粒剂 四川川大华西药业 Z20050308 0804012 独一味片剂 广州白云山制药 Z44020946 10800013 独一味胶囊剂 甘肃独一味生物制药 Z10970053 07100253314 独一味胶囊剂
9、 甘肃独一味生物制药 Z10970053 08060223205 独一味软胶囊 海南神同洲制药 Z20050090 200804296 独一味软胶囊 江苏万高药业 Z20050221 08022917 奇正消痛贴膏 甘肃奇正藏药 Z54020113 0908542 方法与结果2.1 色谱条件Symmetry C18色谱柱(4.6 mm150 mm，5 m, Waters)；梯度洗脱， 0-9 min乙腈-水(9: 91) ，9-20 min乙腈- 水(15: 85)，流速 1.0 mlmin-1；检测波长235 nm；柱温20 C；进样量10 l。在此色谱条件下，所有样品在与山栀苷甲酯对照品相
10、同保留时间处有良好的色谱峰，与其它组分可达基线分离（图 1） 。【基金项目】全军中医药研发推广项目(2006032001); 甘肃省科技攻关项目(2GS054-A43-014-14).【作者简介】何希瑞(1985- ), 男, 硕士研究生, 主要从事天然活性成分筛选与中药新药开发; Tel:（0931）8994676, E-mail: .【通讯作者】*贾正平(1957-), 男, 主任药师, 博士生导师; Tel:（0931）8994676, E-mail: limaox2005 .A BC DE FG H图 1 独一味制剂 HPLC 色谱图A: 山栀苷甲酯对照液 B: 独一味颗粒剂(四川)
11、C: 独一味片剂(广州)D: 独一味胶囊剂(甘肃, 0710025331 ) E: 独一味胶囊剂(甘肃, 0806022320 )F: 独一味软胶囊(海南) G: 独一味软胶囊(江苏) H: 消痛贴膏(甘肃)2.2 对照品溶液 精密称取 50 C 干燥至恒重的山栀苷甲酯对照品 19.2 mg 置 100 mL 容量瓶中，甲醇加至刻度，得浓度为 192 gmL -1 的对照品母液。2.3 供试品溶液 取独一味胶囊 20 粒，倒出内容物，研细；取独一味颗粒剂 10 袋，倒出内容物，研匀；取独一味软胶囊 20 粒，剪破外壳，挤出内容物，混匀；取独一味片剂 20粒，去除薄膜包衣，研细；取奇正消痛贴膏
12、10 片，撕开，倒出内容物，研细；精密称定上述样品各 0.5 g, 平行称定 3 份于具塞三角锥瓶中，精密加入 70 %甲醇 25 mL，密塞，称定重量，加热回流 60min，放冷，再称定重量，用 70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液，以注射用水依次稀释配制，使山栀苷甲酯浓度分别为 9.6，19.2，38.4 1，57.6，76.8，96.0，115.2 gmL -1 的对照品梯度溶液，分别进样10 L，以色谱峰面积和浓度进行回归分析，得回归方程 A = 8150.1C- 6675.1(r = 0.999 8)，表明山栀苷甲酯的浓度在
13、 9.6-115.2 gmL 1 范围内与峰面积呈良好线性关系。2.5 精密度试验 精密取 38.4 gmL -1 对照品溶液 10 L, 分别于第一天，第二天，第三天各重复进样 5 次并测定山栀苷甲酯峰积分面积及保留时间，计算日内、日间精密度，日内精密度 RSD 分别为 0.17 %，0.63 %，0.16 % ，日间精密度 RSD 为 0.97 %，精密度良好。2.6 重复性试验 精密称取同一样品 6 份，测得其中山栀苷甲酯的含量分别为4.38，4.48，4.46，4.49，4.45，4.52 mgg -1，平均为 4.46 mgg-1，RSD 为 1.07 %。2.7 稳定性试验 精密吸
14、取同一样品溶液分别在 0，2，4，8，12，24，48，72 h 测定峰面积积分值，RSD 为 1.42 %，表明样品溶液在 72h 内基本稳定。2.8 加样回收率试验 取已知样品含量的供试品适量 6 份，加入对照品 0.92 mg，混匀，按 2. 3 项下制备供试品溶液，按 2. 1 项下测定色谱峰面积，计算山栀苷甲酯的含量及相应的加样回收率，结果见表 2。表 2 加样回收率试验结果 (n=6)No. 原含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1 0.92 0.96 1.8677 98.722 0.92 0.96 1.8623 98.163 0.92
15、0.96 1.8432 96.17 97.69 1.954 0.92 0.96 1.8876 100.795 0.92 0.96 1.8398 95.816 0.92 0.96 1.8466 96.522.9 样品含量测定 按 2. 3 项下方法制备独一味不同制剂的供试品溶液，按 2. 1 项色谱条件测定山栀苷甲酯的色谱峰面积，根据标准曲线计算含量，每个样品含量为平行测定 3 次所得平均值( n = 3)，结果见表 3。表 3 样品含量测定结果( n = 3)样 品 剂 型 批 号含 量(mgg-1)每剂重量(g)每剂含量(mg)每次使用剂量(mg)1 颗粒剂 080401 1.84 3.00
16、 5.52 5.522 片剂 1080001 12.56 0.30 3.77 11.313 胶囊剂 0710025331 12.55 0.28 3.52 10.564 胶囊剂 0806022320 9.24 0.28 2.59 7.775 软胶囊 20080429 4.46 0.64 2.85 8.556 软胶囊 0802291 0.88 0.55 0.48 1.447 贴膏(复方) 090854 0.92 0.80 0.74 0.743. 讨论作者借鉴正在公示的 2010 年中国药典中关于独一味制剂的山栀苷甲酯测定方法，采用梯度洗脱法，流动相 09 min 乙腈- 水(9: 91)，920
17、min 乙腈-水(15: 85)，检测波长235 nm 下，山栀苷甲酯保留时间为 9.40 min。相比于 8-O-乙酰山栀苷甲酯，山栀苷甲酯极性较大，选择梯度洗脱，实现了很好的分离效果。另外由于样品 2、3、4 中山栀苷甲酯含量较大，超出标准曲线的范围，HPLC 测定前先将这 3 种样品溶液稀释 5 倍再进行测定并计算其含量。本试验采用高效液相色谱法，测定了不同厂家生产的独一味不同制剂中山栀苷甲酯的含量，其方法简便、准确、灵敏、回收率效好，可为该类制剂的质量控制提供一个有效的质量控制指标。不同厂家生产的独一味不同制剂中检测出的山栀苷甲酯含量差异较大，且这种差异与课题组测定的8-O-乙酰山栀苷
18、甲酯含量基本类似，新版药典联合控制独一味药材及其制剂中的山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯含量可以 更好的保障药品质量。参考文献1 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草M.第 7 卷; 上海科学技出版社, 1999：6074.2 Zhang CZ, Li C, Feng SL, et al. Iridoid glucosides from phlomis rotata J. Phytochemistry, 1991, 30(12): 4156.3 Tan JJ, Tan CH, Li M, et al. Iridoid Glycosides from Lamiophlomis rotata
19、 J. Helvetica Chimica Acta, 2007, 90: 143.4 Li MX, Jia ZP, Hu ZD, et al. Experimental study on the Hemostatic Activity of Tibet medicinal herb Lamiophlomis rotata J. Phytotherapy Research, 2008, 22: 759.5 Li MX, Zhang RX, Jia ZP, et al. Isolation and identification of hemostatic ingredients from Lam
20、iophlomis rotata (Benth.) Kudo J. Phytotherapy Research, 2009, 23(6): 816.6 Li MX, Shang XF, Jia ZP, et al. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of iridoid glycosides extract of Lamiophlomis rotata (Benth.) KudoJ. Fitoterapia, 2010, 81, 167.7 李茂星, 李文斌, 樊鹏程, 等. 独一味制剂中 8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量测定.中国医院药学杂志, 2009, 29(8): 688.8 王娟, 李茂星, 李文斌, 等. 独一味药材中 8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量测定.中国药房, 2009, 20(33): 2595.
