1、一、如何选择液相色谱仪 一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：一主要技术指标优异：首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度，定性定量重复性等。这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用个检测器或是泵的。然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。1噪音是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动
2、。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。2最小检测浓度（最小检测限）是反映仪器灵敏度的重要参数。CL=2NdC/H（CL ：最小检测浓度 Nd:噪音 C：样品浓度最小检测浓度 H：样品峰高）由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。3漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上
3、提高了分析效率。 4定性定量重复性主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如：泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。例如：某些公司在公布的指标中，噪音和漂移指标写的条件是空池或有的干脆不写。这个指标只考核了 UV 检测器光学和电气的特性，与实际情况相差甚远，并没有考验泵的压力脉动，液流回路的阻尼和 UV
4、 检测器流通池的性能。所以我们认为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平。二操作方便：操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单，有利于提高分析效率，也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。上海伍丰科学仪器有限公司的 WS-100 工作站软件实现了真正的智能化操作。它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念，率先在国内推出了集控制与后处理于一身的软件，在操作使用上给用户带来了极大的方便。三系统的，整体开发这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区。液相色谱是个复杂
5、的系统，不是整体开发的，各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。整体开发的主要优点有：各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的，所以能够保证仪器的整体水平。四稳定可靠，故障率低这个大家都知道，就不多说了。 二、液相色谱仪的最小检测浓度和流通池的光程（体积）之间的关系与含义 某些国产仪器在公布其技术指标时，大多只写了“噪音和漂移” 的指标。用户觉得指标都差不多，但却忽略了另外二个较为重要的指标：“最小检测浓度和光程” ，这
6、二个指标有什么作用呢？它们代表了什么含义？这里来解释一下：最小检测浓度是考验仪器的灵敏度。最小检测浓度数值大，仪器的灵敏度就小，不能反应真正的噪音和漂移水平。例如：我公司的最小检测浓度小于 110-8g/ml (萘/ 甲醇溶液) ，而某些仪器是：410-8g/ml (萘/ 甲醇溶液) 。这就说明我们的仪器灵敏度大，可以检测更微量的样品。同样如我公司仪器把最小检测浓度调较得和其它产品是一样，也就表明我们可以做得比其它产品噪音和漂移低 4 倍。可以从这个公式看出：最小检测浓度=2仪器的噪音进样的样品浓度/ 样品的峰高值那光程又代表什么？我们先看下面一个公式，比尔定律：A=log(I0/I)=CLA
7、 是吸收率；I0 代表参照池的光强； I 为样品池的光强； 为摩尔吸光系数；C 是样品浓度；L 就是流通池的光程。可以看出在同样的“C” 样品浓度情况下， “L”流通池的光程越大,仪器的“A 吸收率”也就越大。这样可以检测到的样品浓度就越小。为什么有些厂家把仪器的流通池光程做得很小，有些只有：3.5mm、4.5mm 或 5.5mm，而不是我公司的 8mm。这是因为这些厂家不能有效的降低整个系统的“噪音和漂移水平 ”，只能牺牲流通池光程，也就是牺牲了仪器的检测灵敏度和最小检测浓度，来达到降低“噪音和漂移水平” 目的。用通俗的说法比喻： HPLC 就是一台音响，光程就是这台音响的音量控制键，光程越
8、小就是把音量调小了，耳朵对音响本身的噪音和失真（可以理解为仪器的噪音和漂移）感觉就越小。但也就说明了这些仪器整体系统的制造水平不高。三、液相色谱仪对流动相的要求 1.首先必须是 HPLC 级的，这一条相信大家都做到了。2.脱气。由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此，流动相在使用前必须经超声脱气 30 分钟以上。3.过滤。由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。四、高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决
9、方法 在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡。由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。常用的脱气方法有以下几种：1. 吹氦脱气法 使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在 0.1Mpa 压力下，以约 60ml/min 流速通入
10、流动相 10-15min 以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；2. 加热回流法 此法的脱气效果较好；3. 抽真空脱气法 此时可使用微型真空泵，降压至 0.05-0.07MPa 即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和 G4 微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。4. 超声波脱气法 它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气 10-20min 即可。该方法
11、操作简便，基本能满足日常分析的要求。5. 在线真空脱气法 把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。其二，在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。其三，在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。五、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之一） 仪器安装条件与注意事项安装本仪器的实验台应水平、稳固、并具有足够的放置空间。避免在具有腐蚀性气体、大量灰尘或能产生强磁场的地方安装本仪器，否则将会影响仪器的正常运转及缩短仪器的使用寿命。由于仪器所用溶剂
12、是易燃并且有毒，故安装设备的房间应通风良好，应具有向外排风的装置，否则可能会引起中毒或身体不适，也可能会引起火灾。应安装四个以上三芯电源插座（220V，510A），必须具有专门的接地线（注意 ,绝不能将电源线的中线作为接地线），并确保输出电源的电压稳定，否则会导致仪器的不正常运作。如果实验室无专用的接地线，一般可用 1520mm 的铜棒打入地下 11.5 米，用 1.2mm 左右的塑胶单股导线连接到电源插座的接地端。如果实验室电压不稳定，应使用稳压器等必要设备，使电源电压稳定。实验室的室温应控制在 15-30范围内，并且波动要小；湿度在 4585%范围内。由空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器
13、，避免光线直射及振动。仪器的启动顺序：先开高压恒流泵和紫外检测器，待紫外检测器自检完毕，回到默认波长254nm 后，再开计算机及打开工作站软件。仪器关闭顺序：先按泵停止，关闭氘灯，退出工作站软件，然后再关仪器。仪器应由专人负责，如果使用人员不固定，请准备仪器使用登记本，以明确使用情况，及时处理和保养。六、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之二） 流动相使用的注意事项必须使用 HPLC 级或相当于该级别的流动相，并要先经 0.45m 薄膜过滤。过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如 O2），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。几中脱气方法比较：1.
14、氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。2. 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。3. 抽真空脱气法：易抽走有机相4. 超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡 1015 分钟，此法效果并不是太好，但操作简单。如果管路中使用 peek 树脂部件，请不要使用下列流动相：浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜特别注意：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1 先用 1090 的甲醇/水冲洗，以洗去缓冲盐，清洗时间至少为一小时。2 再用 9010 的甲醇/水，冲洗系统，并将系统保存在该流动相
15、中。清洗时间至少为 40 分钟。七、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之三） 流动相的更换在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能够相溶的流动相进行过渡、清洗。较为常用的过渡流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能够相溶的流动相。一般清洗的时间为 3040 分钟，直至系统完全稳定。如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路堵塞。严重时将引起流通池污染堵塞，不得不更换流通池
16、。用户就要承担不必要的损失了。储液器的注意事项：保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用 HPLC 级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非 HPLC 级的流动相一定要用 0.45m 过滤器除去其中的微粒物质。八、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之四） 管路连接的注意事项1. 将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则将产生死体积，引起峰展宽。2. 为了使柱外效应减到最小，获得理想的分析结果，尽量使用管径细的管路作为连接。3. 管路接头不要拧的过紧，以防损坏螺纹。九、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之五） 基本操作注意事项泵运行前先打开排空阀，用注射器抽出流动相，观察 1
17、0 秒，流动相应连续流出。不用排空阀时应将其关闭，否则大气压力会使流动相从排空阀出口流出。在使用仪器过程中，注意贮液瓶里的流动相是否够用，如快用尽，应及时更换。更换流动相时务必停泵，防止吸入大量空气，影响仪器正常运作。在启动分析进样时，请快速板动 7725i 进样阀，否则会引起系统压力突跳，影响仪器的使用寿命。如对样品分析的定性定量要求较高，应配置柱温箱，保持温度恒定。若流动相不是纯甲醇，样品分析结束后，必须用 HPLC 级甲醇对泵及进样阀进行清洗，大约半小时后，待压力重新回落并稳定，方可关泵。若流动相中含有缓冲盐，则须根据其特殊的清洗方法进行清洗（上述提到过）。十、液相色谱系统的日常维护及注
18、意事项（之六） 氘灯的保养紫外检测器中的氘灯是有一定的使用寿命的。为了节省灯的使用寿命，在暂时不使用时可在不关机的情况下，只把灯关掉（建议：最好在需要关灯时间 4 小时以上才关灯，因为频繁的开关灯，同样会缩短灯的使用寿命）。十一、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之七） 色谱柱的保养事项为了保护色谱柱，延长其使用寿命，在使用时应采取下列几方面措施：应在柱头加烧结片不锈钢滤片，需要时加保护柱，防止柱头堵塞，影响分析效果。当流动相的 PH7 时，要用大粒度同种填料作预柱。溶剂的化学腐蚀不能太强。要避免微粒在柱头沉降。为防止高压冲击，泵上的压力限制不宜太高，一般在 1520MPa 为宜，在旧柱或梯度
19、洗脱时应稍高些，以避免因上限设置过低而造成正常使用中的中途停机。色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂（甲醇或乙腈） ，两端封死。十二、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之八） 手动进样阀的维护注意事项在每次使用后，尤其是进浓度差异比较大的样品时要用专用工具（不是带针头的注射器）冲洗进样阀，冲洗时必须冲洗进样阀两头数次，每次数毫升。以防止无机盐沉积和样品微粒造成阀内部磨损或阻塞以及样品的交叉污染。安装时进样阀的 5，6 出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。进样量的多少要根据定量管的环体积决定：当样品量较少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大体积要
20、小于环体积的 1/2。当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动相置换干净，需注射 5-6 倍的环体积。要使用专用的液相注射器进样，绝对不可用气相注射器。注射器前应用专用的样品过滤器。十三、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之九） 高压恒流泵的维护注意事项泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命：绝对不允许在没有流动相或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵
21、冲洗整个管路。要用 HPLC 级试剂。输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。压力下限应设置在 0.51MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞杆的干磨。有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。十四、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之十） 泵的压力不稳定在安装调试时以及在日常使用过程中，若出现压力不稳的现象。原因有几点：一 管路里有气泡，建议由流动相多走些时间。或打开排空阀，用配件里的针筒多抽几下。二 输入单向阀失效所致，这也是经常遇见的。首先如何判断输入单向阀失效。判断步骤为：如果是双泵梯度分析系统，故
22、泵压力不稳必然是其中一台泵压力不稳所致，须逐个分析。1 在不开 UV 检测器，工作站的前提下，将其中一台泵接上蒸馏水作为流动相。2 打开排空阀，用针筒抽出些流动相，确认泵中已有该流动相，然后将针筒内的液体排出，并重新接在排空阀上。3 按“ 设置”键直至出现“冲洗”字样，选择是，并启动冲洗功能。流量 5ml/min，时间 5min（注意：此时排空阀仍要打开，否则将冲坏色谱柱）4 冲洗完毕后，查看针筒内流动相体积是否为 25ml（55=25），若正确，则说明该泵在低压情况下无故障；若不正确，则说明该泵中某一单向阀失效（一般为输入单向阀）。5 用同样方法测试另外一泵。等度只要测试一台就可以了。造成单向阀失效原因有几点：1 液相色谱从成品到客户手中有一段时间，出厂前每台仪器都要经过调试，一段时间内不用会造成内部残留流动相与宝石球粘连的情况。客户长期不用也会造成类似情况，建议客户在长期不使用情况下，每周用甲醇作为流动相，开机 1 小时使管路充满液体。2 流动相内杂质或其它原因污染了单向阀。虽然有的客户认为流动相已过滤过了，但长期使用后，由于液相色谱是微量分析仪器，难免会产生类似情况。这是液相色谱的普遍现象，国内外的泵只要是被动单向阀，都会有类似现象发生，这并不是仪器的质量问题，而是日常维护的一部分。现在介绍一个简单而有效的单向阀失效的处理办法。
