1、 53 药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则一、概述刺 激 性 、过 敏 性 、溶 血 性 是 指 药 物 制 剂 经 皮 肤 、粘 膜 、腔 道 、血 管 等非 口 服 途 径 给 药 ，对 用 药 局 部 产 生 的 毒 性 （如 刺 激 性 和 局 部 过 敏 性 等 ）和/或 对 全 身 产 生 的 毒 性 （如 全 身 过 敏 性 和 溶 血 性 等 ），为 临 床 前 安 全 性 评价 的 组 成 部 分 。药物的原形及其 代 谢 物 、辅料、有关物质及理化性质（如pH 值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位
2、使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围。本指导原则适用于中药、天然药物、化学药物。二、基本原则（一）试验管理根据药品注册管理办法，药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行药物非临床研究质量管理规范（GLP）。（二）随机、对照、重复试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。（三）整体性、综合性原则应根据受试物特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学及拟临床应用情况等综合评价，体现整体性、综合性的原则。（四）具体问题具体分析 54 应在遵循安全性评价普遍规律的基础上，具体问题具体分析，结合受试物的特点，在阐明其研究方法或技术科学、合理的前提下进行规范
3、性试验， 对试验结 果进行全面分析评价。三、基本内容（一）受试物和实验动物1受试物中药、天然药物：受试物应能充分代表临床试验样品或上市药品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，由于中药的特殊性，建议现用现配，否 则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、规格及生产单位。化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的 样品。受试物应注明名称、来源、批号、含
4、量（或规 格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。 试验中所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产单位，并符合试验要求。在药品研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相 应的安全性研究。化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。2实验动物 55 动物应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证。动物种属的选择根据观察指标和模型合理性确定，如刺激性试验应选择与人类皮肤、粘膜等反应比较相近的动物，如兔、小型猪等。（二）刺激性试验刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反
5、应，若给药 部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验是观察动物的血管、肌肉、皮肤、粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。1给药部位一般应选择与临床给药相似的部位，并观察对可能接触到受试物的周围组织的影响。2给药途径一般应与临床用药途径一致，否则应加以说明。3对照组 以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照，必要时采用已上市制剂作对照。4给药浓度、剂量与体积可选择几种不同浓度，至少应包括临床拟用最高浓度。如果技术上难以达到临床拟用最高浓度，如皮肤刺激性试验，在给药面积不变的情况下，可通过改变给药频次进行剂量调整，而不应通过增加厚度来达到增加给药量的目的。设计给药
6、浓度、剂量与体积时，应根据临床用药情况，并考虑受试动物给药部位的解剖和生理特点，保证受试物在给药部位的有效暴露。5给药频率与周期 56 应根据临床用药情况，一般给药周期最长不超过4周。建议进行恢复期观察，同 时评价给药局部及周围组织毒性反应的可逆性。6观察指标6.1 肉眼观察 应详细描述局部反应，包括红 斑、水肿、充血程度及范围， 计分表示。同 时观 察动物的一般状态、行为、体征等。6.2 组织病理学 检查 应详细描述给药部位的病理 变化，并半定量分析、判断。提供相应的 组织病理学照片。7试验方法具体可参考附录中常用方法和相关文献。8统计方法根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。（三）过敏
7、性试验过敏性又称超敏反应，指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应。过敏性试验是观察动物接触受试物后的全身或局部过敏反应。1试验方法进行何种过敏性试验应根据药物特点、临床适应症、给药方式、过敏反应发生机制、影响因素等确定。通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察型过敏反应，如注射剂需进行主动全身过敏试验（Active Systemic Anaphylaxis, ASA）和被 动皮肤过敏试验（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA），透皮吸收剂需进 行主动皮肤过敏试验（Active Cutaneous 57
8、 Anaphylaxis, ACA）。吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药应结合受试物的特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。如受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者建议考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如光过敏性反应等）。和型过敏反应可结合在重复给药毒性试验中观察，如症状、体征、血液系统、免疫系统及相关的病理组织学改变等。经皮给药制剂（包括透皮剂）应进行 IV 型过敏反应试验，包括豚鼠最大化试验（Guinea-Pig Maximization Test, GPMT）或豚鼠封闭斑贴试验（BuehlerTest ）或其他合理的试验方法如小鼠
9、局部淋巴结试验（Murine Local Lymph Node Assay, LLNA）等。2剂量设计建议选择多个剂量，至少应包括临床最高给药浓度。3对照组应设立阳性对照组和阴性对照组，必要时采用已上市制剂作对照。4统计方法根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。（四）溶血性试验溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。溶血性试验是观察受试物是否能够引起溶血和红细胞凝聚等。1. 适用范围凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他局部用药制剂均应进行溶血性试验。 58 2. 试验方法溶血试验包括体外试验和体内试验，常规采用体外试管法评价
10、药物的溶血性，若结果为阳性，应与相同给药途径的上市制剂进行比较研究，必要时进行动物体内试验或结合重复给药毒性试验，应注意观察溶血反应的有关指标（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白，肾脏、脾脏、肝脏继发性改变等），如出现溶血时，应进行进一步研究。（五）光毒性（光刺激性）试验光敏反应是用药后皮肤对光线产生的不良反应，包括光毒性反应和光过敏反应，均由受试物所含的感光物质引起，产生光敏反应需同时满足以下条件：吸收自然光线（波长范围为 290700nm），吸收 UV/可见光后产生活性物质，在光暴露组织（如皮肤，眼睛等）有充分的暴露。光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，是指药物吸收的光能量在皮
11、肤中释放导致皮肤损伤的作用。光毒性反应是光敏反应中最常见的一种反应，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着，严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。皮肤给药光毒性试验的目的是观察受试物接触皮肤或应用后遇光照射是否有光毒性反应。若受试物的化学结构或某些组成（包括药物和赋形剂）文献报道有光毒性作用，或其化学结构与已知光敏剂相似，或曾有报道其具有或可疑具有光毒性作用，建议进行皮肤给药光毒性试验。四、结果分析与评价（一）详细说明实验方法，受试物、试验分组、给药剂量、动物数、用药次数、毒性反应、持 续时间、恢复情况及 时间 、死亡动物数等，对不同剂量 59 （或浓度）下某种反应发生情况
12、及严重程度进行表述，分析毒性反应的量效关系和可能的时效关系及可逆性，判断药物相关性，提供安全范围等。（二）刺激性试验应重视给药浓度、体积、速度、次数与有效暴露时间对结果的影响。注射剂的给药浓度、速度及次数与药物的血管刺激性密切相关，建议 根据受试物的性质、临床用药情况，采用适当的方法，尽最大可能地暴露毒性，如可适当增加浓度，或通过增加给药次数等。过敏试验应注意给药剂量和给药速度对过敏反应的影响，静脉注射激发应保证足量、一次性快速地将受试物注射入动物体内。经皮给药的受试物应保证在局部的有效暴露浓度和时间。（三）重视组织病理学检查，并提供相应的照片。（四）由于实验动物模型的局限性，如目前仍无理想的
13、和型过敏反应的动物模型；光过敏性动物模型的临床意义尚不明确等，因此一些药物的过敏性临床前评价可采取灵活的方式，建议采用多种方法如BT、小鼠局部淋巴结试验等。（五）在溶血性试验中，若出现红细胞凝聚现象，应判定是真凝聚还是假凝聚。若体外出现可疑溶血现象，应采用其他方法进一步试验，以确定或排除受试物的溶血作用。利用分光光度法进行溶血性试验时，应注意离心速度及温度对结果的影响。此外，因不同的注射剂颜色及深浅不同，若其色泽对血红素的最大吸收有干扰，则应注意排除非药物因素。（六）结合药物的制剂特点、药理作用其他毒理学试验结果、以及临床信息等综合分析和评价。五、参考文献 60 1FDA Guidance f
14、or Industry Skin irritation and sensitization testing of generic transdermal drug products2FDA Guidance for Industry Photosafety testing3FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of investigation new drug4. EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 Immunotoxicity5EPA Health effec
15、ts test guidelines OPPTS 870.2500 Acute dermal irritation6EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2600 Skin sensitization7OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992)8EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2400 Acute eye irritation9EMA Non-clinical local tolerance testing
16、of medicinal products10ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices- Part 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity11日本厚生省日本新药毒性试验指导原则 1989 版12中华人民共和国卫生部药政局 新药（西药）临床及临床前研究指导原则汇编13徐叔云 卞如濂 陈修 药理实验方法学14陈奇 中药药理研究方法学 61 15皮肤用药的毒性试验和粘膜用药的毒性试验. 中华人民共和国卫生部药政管理局 中药新药研究指南1994
17、 年 209，21316袁伯俊 王治乔 皮肤用药毒性试验. 新药临床前安全性评价与实践 北京：军事医学科学出版社，1997 年 15217刘建文 其他毒性试验. 药理实验方法学第三版. 北京：人民卫生出版社，2002 年 23418. Principles and methods of Toxicology. Fourth edition, edited by A. Wallace Hayes, Taylor & Francis, Philadelphia. 2001.19. EMA；Note for Guidance on Non-clinical Local Tolerance Testi
18、ng of Medicinal Products.20FDA；Guidance for Industry Botanical Drug Products21FDA；Guidance for Industry Labeling Guidance for OTC Topical Drug Products for the Treatment of Vaginal Yeast Infections (Vulvovaginal Candidiasis) 22. FDA；Guidance for Industry Bacterial Vaginosis - Developing Antimicrobia
19、l Drugs for Treatment23Preclinical Development Hand Book-Toxicology. Edited by Shayne Cox Gad, Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc六、附录本附录收载的试验方法仅供参考。应根据受试物的特点采用国内外公认的科学合理的试验方法，不仅限于此附录。 62 （一）刺激性试验方法1血管刺激性试验通常选兔，每组不少于 3 只。设生理盐水和/或溶媒对照，可采用同体左右侧自身对比法。给药部位根据临床拟用途径确定，一般选用耳缘静脉。可设多个给药浓度，至少包括临床最大拟用浓度，给
20、药容积、速率和期限一般根据临床拟用法用量，并根据动物情况进行调整，给药体积不可太低。多次给药时间一般不超过 7 天。根据受试药物的特点和刺激性反应情况选择观察时间和剖检时间，至少观察 72 小时。应对部分动物进行组织病理学检查。恢复期动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察 1421 天进行组织病理学检查。根据肉眼观察和组织病理学检查结果综合判断受试物的血管刺激性及刺激性恢复情况。2. 肌肉刺激性试验通常选兔，也可选用大鼠。每组不少于 3 只。应设生理盐水对照或/和溶媒对照组，可采用同体左右侧自身对比法。根据受试物的特点和刺激性反应情况选择观察时间, 观察期结束时应对部分动物进行组织病理学检查。分别在左右两侧股四头肌内注射给药，观察给药后不同时间的局部反应，如充血、红肿等。 给药 后 4872 小时剖 检观察注射局部的刺激反应，按表 1 计算相应的反应级，并进行局部组织病理学检查，提供病理照片。
