1、基金项目 贵州省国际科技合作重点项目黔科合外 G 字（2008）700107通信作者 *时京珍，教授，硕士生导师，Tel:13985134840,E-mail:作者简介 何海洋，硕士研究生，从事中药毒理研究，E-mail:朱砂、朱砂安神丸与氯化汞、轻粉的急性毒性对比研究何海洋 1 康峰 1 颜俊文 2 刘杰 2 时京珍 1*(1.贵阳中医学院实验中心基础医学实验室,贵州 贵阳 550002; 2. 遵义医学院药理学教研室,贵州 遵义 563000)摘要 目的：对比研究朱砂、朱砂安神丸与氯化汞、轻粉对小鼠的急性毒性。方法：小鼠一次给药后，分别检测肝肾组织中汞蓄积量，肝肾功能，观察肝、肾、等主要脏
2、器的组织形态学变化，并运用实时荧光定量 PCR(RT-PCR)的方法检测药物对 MT-1、MT-2 基因表达的影响。结果：氯化汞组小鼠肝、肾组织中汞蓄积量远远高于朱砂组、朱砂安神丸组和轻粉组；朱砂高剂量组、氯化汞组肝、肾组织中 MT-1 和 MT-2 mRNA 表达高于其他各组；朱砂高剂量组和氯化汞组小鼠肝肾组织中出现病理损伤。结论：小鼠一次性给药后，临床常用量的朱砂和朱砂安神丸毒性要远远小于氯化汞。关键词 朱砂 朱砂安神丸 氯化汞 轻粉 毒性 朱砂为硫化物类辰砂族矿石，又名丹砂，辰砂。入药始载于神农本草经至今已有2000多年历史。其具有清心镇惊，安神解毒的功效 1。朱砂主要成分为HgS，另外
3、还含有少量的游离汞和可溶性汞盐。轻粉（Hg 2Cl2） ，又名甘汞，也是一种含汞的矿物药。由于朱砂和轻粉都含汞等重金属离子,自古以来就被认为是一种有毒之品,在国外甚至限制其使用, 质疑甚至反对朱砂和轻粉入药者颇有人在,大大影响了其在临床上的应用。朱砂安神丸是临床上常用的安神中成药，但其汞含量超欧洲药典标准10万倍 3，究竟朱砂安神丸有多毒？朱砂毒性能否与其他含汞化合物如氯化汞（HgCl 2）相提并论？本文通过对 HgCl2 、轻粉、朱砂及朱砂安神丸的急性毒性对比研究，来探讨朱砂及其复方（朱砂安神丸）的毒性。1 材料1.1 动物 清洁级昆明种小鼠，体重2022 g，雌雄各半，由重庆市第三军医大学
4、提供，许可证号：SCXK（渝）2007001。1.2 主要药品与试剂 朱砂，购自贵州省万山特区矿产公司；朱砂安神丸，购自哈药集团世一堂制药厂(批号：0806708)；氯化汞，轻粉，均购自美国Sigma公司，Trizol、逆转录试剂盒、PCR引物，均购自宝生物工程（大连）有限公司；Power SYBRGreen PCR Master Mix，购自美国ABI公司；RNA纯化试剂盒，购自上海华舜生物技术有限公司。1.3 主要仪器 F732-V型冷原子吸收测汞仪，上海华光仪器仪表厂；原子荧光光谱仪，北京科创海光仪器有限公司；实时荧光定量PCR（RT-PCR）仪，美国BIO-RAD公司；TU-1810紫
5、外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；多功能梯度PCR仪，德国Eppendorf公司。2 方法2.1 动物分组与给药方法 将42只小鼠称重后随机分为7组，每组6只，雌雄各半：空白对照组，给予正常饮食；朱砂安神丸低剂量组，10 gkg - 1（Hg质量分数0.9 gkg- 1） ，ig。朱砂安神丸高剂量组，20 gkg - 1（Hg质量分数1.8 gkg- 1） ，ig。朱砂低剂量组，0.3 gkg - 1（Hg质量分数0.26 gkg - 1） ，ig。朱砂高剂量组，16 gkg - 1（Hg质量分数13.
6、3 gkg - 1） ，ig, HgCl 2组，70 mgkg- 1（Hg质量分数0.05 gkg - 1） ，ig , 轻粉组，61.2 mgkg - 1（Hg质量分数0.05 gkg - 1） ，ig ,各组小鼠均早晨给药一次。8小时后断头处死，取血、肝脏和肾脏。2.2 肝肾功能检测 血液离心取血清，按照试剂盒说明书测定血清谷丙转氨酶（ALT） 、谷草转氨酶（AST） 、尿素(UREA)和肌酐（CREA） 。2.3 病理学检测 取小鼠肝脏的同一部位、同侧肾脏，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察其组织病理变化。2.4 肝肾组织中MT-1、MT-2基因表达的检测 按照试
7、剂盒说明书提取并纯化RNA， 并分别在260nm和280nm处测其吸光度,计算出A260/A280的值。然后应用PCR仪进行逆转录，反应条件：25，10 min；48，60 min；95，5 min；4后适当时候取出。反应结束后,加DEPC水，1：1稀释。PCR扩增：PCR总反应体系为15l,其中包括：cDNA 3l，SYBR GREEN PCR Master Mix 7.5l,DEPC水4l，混合引物 0.5l，然后应用iCycler iQ realtime PCR仪进行扩增，扩增条件：，95，10 min；95,15 s；60,60 s。40个循环。引物由宝生物工程有限公司设计并合成，MT
8、-1同义链：5- AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3反义链：5-GCTGGGTTGGTCCGATACTATT -3；MT-2 同义链：5- TGTGCCTCCGATGGATCCT -3反义链：5- GCAGCCCTGGGAGCACTT -3；以18S为内标，同义链：5- CGAACGTCTGCCCTATCAACTT-3反义链：5- CCGGAATCGAACCCTGATT-3。数据处理：以Ct值为统计参数计算下列数据：平均Ct值（Ct1+Ct2）/2；dCt=均数-中间值；基因的表达以2(- dCt)表示；以 MT-1、MT-2基因的表达/18s基因的表达对每个MT-1、MT-2 mRN
9、A进行相对定量。2.5 肝肾组织中汞蓄积量测定 参照文献 2方法测定肝肾组织中汞的蓄积量，称取适量组织于消化罐中，加入5 mL浓硝酸，170烘箱中消化3个小时，取出后用去离子水定容至25 mL。测汞仪预热半小时后,吸取溶液5 mL于汞气发生瓶中,用去离子水补足至15 mL,加入200 gL - 1的氯化亚锡1mL,立即通气进行测定。标准曲线的绘制：方法同上，分别吸取40 ngmL - 1的汞标准液0、1、2、3、4、5、10 mL于汞气发生瓶中，加入氯化亚锡后立即进行测定。标准曲线回归方程为： Y=0.0004X+0.0026,r =0.999。2.6 统计学处理 实验数据以均数标准差表示,应
10、用SPSS13.0软件进行单因素方差分析检验。 P0.05表明有显著差异。3 结果3.1 小鼠肝功能检测 结果显示，小鼠一次给药后，药物对其肝功能并无影响，各组小鼠血 ALT和 AST检测结果与空白对照组相比无统计学意义。HgCl 2组小鼠血UREA的水平明显高于空白对照组（ P0.05）,表明HgCl 2对小鼠肾脏功能造成了损伤。 （见表1）表1 几种含汞药物对小鼠肝肾功能的影响组别 剂量（gkg - 1 ） ALT（UL - 1） AST（UL - 1） UREA(mmolL - 1) CREA(moL - 1)空白对照组 4914.9 28551.6 9.212.52 181.94朱砂安
11、神丸低 10（0.9） 548.64 28765.1 9.042.19 171.97朱砂安神丸高 20 （1.8） 6527.9 31399.4 7.482.44 162.17朱砂低剂量组 0.3（0.26） 6410.1 32954.1 11.783.41 174.63朱砂高剂量组 16（13.3） 6216.6 22653.2 8.672.49 152.66HgCl2组 0.07（0.05） 657.16 359128 17.58.77 # 228.71轻粉组 0.06（0.05） 534.58 31468.9 81.69 181.72 注：与空白对照组相比，# P0.05 括号内为汞的实
12、际含量3.2 小鼠肝组织中汞蓄积量的测定 与空白对照组相比，HgCl 2组小鼠肝肾组织中汞蓄积量远远高于其他各组（ P0.05） ，朱砂高剂量组、轻粉组小鼠汞蓄积量也明显增高（ P0.05） ，而朱砂安神丸组、朱砂低剂量组之间无明显差异。（表2）表2 小鼠肝肾组织中汞蓄积量组别 剂量（gkg - 1 ） 肝脏（mgkg - 1） 肾脏（mgkg - 1） 空白对照组 0.070.05 0.080.03朱砂安神丸低 10（0.9） 0.220.23 0.670.43朱砂安神丸高 20 （1.8） 0.310.32 0.720.57朱砂低剂量组 0.3（0.26） 0.180.35 0.500.5
13、7朱砂高剂量组 16（13.3） 3.801.65 # 23.99.95#HgCl2组 0.07 （0.05） 13.27.63 # 46.920.4#轻粉组 0.06（0.05） 0.390.20 # 0.760.48 #注：与空白对照组相比，# P0.05 括号内为汞的实际含量3.3 小鼠肝肾组织中 MT-1 和 MT-2 基因的表达 与空白对照组相比，HgCl 2组小鼠肝肾组织中 MT-1 和 MT-2 基因表达明显高于其他各组，朱砂高剂量组 MT-1和 MT-2 基因表达亦高于其他各组，而朱砂安神丸组、朱砂低剂量组和轻粉组MT-1 和 MT-2 基因表达无明显差异。 （表 3）表3 小
14、鼠肝肾组织中MT-1和MT-2 mRNA的相对表达量组别 剂量（gkg - 1 ） 肝脏 肾脏MT-1 MT-2 MT-1 MT-2空白对照组 10015 10022 10018 10017朱砂安神丸低 10（0.9） 77 18 143111 102 25 10558 朱砂安神丸高 20 （1.8） 16667 18867 81 22 6416 朱砂低剂量组 0.3（0.26） 7718 16975 16728 16224 朱砂高剂量组 16（13.3） 863469 # 1057690# 60330# 3114 313# HgCl2组 0.07（0.05） 1385364 # 228470
15、1# 621186# 3162493# 轻粉组 0.06（0.05） 6460 43 10 58 9 10852注：与空白对照组相比，# P0.05 括号内为汞的实际含量 3.4 病理学检测 朱砂高剂量组及HgCl 2组小鼠肾脏组织肾小球变性，肾小管出现炎症反应，细胞肿胀，出现空泡（见图1） 。朱砂高剂量组及HgCl 2组小鼠肝小叶内出现炎性细胞浸润，肝细胞肿胀，变性，出现点状嗜酸性变（见图2） 。空白对照组 朱砂安神丸（20 gkg - 1 ） 朱砂（0.3 gkg - 1） 朱砂（16 gkg - 1）轻粉组（61.2 mgkg - 1） HgCl 2组（70 mgkg - 1）图1 小鼠
16、肾脏组织病理结果（HE染色，100）空白对照组 朱砂安神丸组（20 gkg - 1 ）朱砂组（0.3 gkg - 1） 朱砂组（16 gkg - 1）轻粉组（61.2 mgkg - 1） HgCl 2组（70 mgkg - 1）图2 小鼠肝脏组织病理结果（HE染色，100）4 讨论 本实验中，单次给药后，朱砂安神丸组（约是临床剂量的5、10倍）小鼠肝肾组织中汞蓄积量很少，对肝肾功能和 MT-1和 MT-2 mRNA的表达也无太大影响，病理结果检查也未发现其对肝肾组织有明显损伤。作者以往的研究结果也发现，小鼠给予20 gkg - 1的朱砂安神丸20天后，药物在肝肾组织中蓄积量很少，对 MT-2
17、mRNA的表达与空白对照组相比无明显差异 3。这都说明，当小鼠给予大剂量的朱砂安神丸（约是临床剂量的10倍）后，在肝肾组织内不会出现明显的汞蓄积，也不会对肝肾造成明显的病理损伤。通过本实验的研究结果，可以发现，一次性大量口服给药后，低剂量的朱砂组（约是临床剂量的5倍）小鼠肝肾组织中汞蓄积量和空白对照组相比无明显差异，病理切片也未发现明显组织损伤，但是高剂量朱砂组（约是临床剂量的200倍）小鼠却出现了明显的毒性反应，表现为肝肾组织中汞蓄积量增高，MT-1和MT-2 mRNA的表达增加，并且出现了病理损伤。相对于高剂量的朱砂，HgCl 2对小鼠的毒性作用更大，表现为肝肾组织中汞蓄积量更高，对MT-
18、1和MT-2 基因的诱导作用更强，并且对肾脏功能产生了影响。这就说明，虽然高剂量的朱砂对小鼠产生了毒性作用，但是其毒性仍低于HgCl 2，也提示了在临床上，朱砂用量在规定的剂量范围内不会产生明显的毒副作用。朱砂的主要成分为HgS， 中华人民共和国药典规定朱砂中HgS含量不得低于96% 4,而HgS为一种共价化合物,极难溶于水,其溶解度仅为1.410 -24g/L5,由于HgS的难溶性,从而必然导致其进入人体后,难以被机体吸收利用，导致生物利用率低，据报道, HgCl 2的口服吸收率为715%，朱砂的口服吸收率仅为0.2%6，而有机汞可高达100% 7。HgCl 2进入体内后，主要蓄积于肾小管上
19、皮细胞，从而导致肾脏的损伤。在本实验中，朱砂和朱砂安神丸在机体中汞蓄积量很低，但给予HgCl 2后却有大量的汞蓄积于肝肾，并对肝肾造成损伤，从而说明，HgS和HgCl 2的性质不同，在体内的吸收代谢途径的不同，因此导致了朱砂及其复方的毒性明显低于HgCl 2。金属硫蛋白（MT）是一种富含巯基的金属结合蛋白，广泛存在于肝、心、肾等器官和组织细胞的胞质中，其可以和多种有毒金属结合，从而解除重金属对人体的毒性，对保护肝、肾等重要器官具有极其重要的意义 89 。MT的诱导是体内汞毒性的敏感标志 9。在本实验中, HgCl 2组小鼠肝肾组织中MT-1和MT-2 mRNA表达显著增高,朱砂高剂量组也有所增
20、高,但要明显低于HgCl 2组,其他组与空白对照组相比无差异。由于HgS在体内汞蓄积量少,从而导致朱砂与其复方中的汞对机体的影响较小,没有影响MT-1和MT-2基因的表达,而HgCl 2在体内的汞蓄积量远远高于其他组,故显著的诱导了MT-1和MT-2基因的表达，这也从一个侧面反映出HgCl 2的毒性要远远高于朱砂及其复方。轻粉（Hg 2Cl2） ，又名甘汞，也是中医常用的一种矿物药，外用有杀菌作用，内服可通利大便，其毒性亦不能与HgCl 2相比。在本实验中，轻粉组小鼠肝肾组织中汞蓄积量要远远低于HgCl 2组，其对MT-1和MT-2基因表达的诱导作用也弱于HgCl2，另外，对肝肾组织也无明显的
21、病理损伤。轻粉虽与HgCl 2的含汞量相同（Hg质量分数0.05 gkg - 1） ，但由于它们的存在形式不同，从而导致其毒性要明显低于HgCl 2。有学者研究报道，朱砂急性毒性很低，小鼠单次灌胃朱砂，即使剂量较大，也不会出现明显的毒性反应，梁爱华等报道一次性灌胃给予朱砂的最大耐受量达到24gkg - 1时，小鼠未出现死亡，也未出现呼吸抑制，抽搐等反应，解剖未见脏器异常病变 10。而在本实验中,当小鼠一次性给予16 gkg - 1的朱砂时,就已经出现了汞蓄积量的增高和基因表达的改变,以及组织的损伤，这就说明，小鼠一次灌胃较大剂量的朱砂时，虽未出现死亡等明显的毒性反应，但是在机体内就已经出现了汞
22、的蓄积和基因表达的改变。所以，虽然朱砂急性毒性很低，但是如果单次给药量过大，同样可以造成机体的损伤。丁国华等在研究大鼠口服朱砂的组织分布时，发现大鼠连续口服朱砂后，心脏、肝脏、肾脏及大脑中均有汞的蓄积，但是以肾脏中汞的蓄积量最高 11，梁爱华等在研究中发现,肾脏中汞的蓄积量要远远高于肝脏 10。文献报道认为含汞中药及其制剂对肾脏的损害最大 12，在本实验中，小鼠一次性灌胃朱砂后，肾脏中汞的蓄积量要高于肝脏，对肾脏的毒性也大于肝脏,这和以往的研究结果相符。近年来,有学者提出以总汞含量作为处方中朱砂的测定指标,并以HgCl 2的毒性代表朱砂的毒性 1。在本实验中，HgCl 2的毒性远远大于朱砂和朱
23、砂安神丸，朱砂即使高剂量（约是临床剂量的200倍） ，其毒性也小于HgCl 2，作者在体外实验中也发现，朱砂及其复方中所含Hg的体外细胞毒性远远要小于HgCl 2313。所以，用HgCl 2的毒性代表朱砂及其复方的毒性显然不恰当，并且以总汞含量作为处方中朱砂的测定指标,也明显不符合科学。作者将在以后的实验中进一步的研究朱砂及其复方的毒性,以期可以正确的评价朱砂及其复方的毒性,确定朱砂及其复方的安全剂量范围，为朱砂及其复方在临床上安全合理的利用提供科学依据。参考文献：1 周超凡，林育华.传统中药朱砂应用概况及其安全性J.药物不良反应杂志,2008,10(3):184-189.2 孙冬杰，白露,王
24、小秋 . 血汞的冷原子吸收光谱测定法J.工业卫生与职业病,2008,34(1):55-56.3 康峰，吴琨，何海洋，等.朱砂、朱砂安神丸与甲基汞、氯化汞的毒性对比研究J.中国中药杂志,2010,35(4):499-502.4 中华人民共和国卫生部药典卫员会.中华人民共和国药典.一部.广州:广东科学技术出版社,1995:144.5 魏金锋.朱砂药理学及毒理学研究概况 J.中草药,1999,30(12:): 953-956.6 Liu J, Shi Jingzhen, Yu Limei, et al. Mercury in traditional midicine:Is cinnabar toxi
25、cologicaolly similar to mercurialJ. Exp Biol Med,2008,233(7):810-817.7 杨秀伟. 中药成分的吸收、分布、代谢、排泄、毒性与药效M.下册,中国医药科技出版社,2006:1829.8 姚朝阳，朱文文，牛敬嫒，等.金属硫蛋白医学研究进展J.微量元素与健康研究,2007,24(3):53-55.9 Klaassen C D, Liu J, Choudhuri S. Metallo thionein,an intracellular protein to ptotect against cadmium toxicity. Annr R
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27、吴琴，等.朱砂及其复方与甲基汞、氯化汞的体外细胞毒性对比研究J. 贵阳中医学院学报,2010,32(2):19-22.Comparative Studies on Acute Toxicity of Cinnabar、Zhusha Anshenwan、 Mercuric Chloride and Mercurous ChlorideHE Hanyang1, KANG Feng1, YAN Junwen2, LIU Jie2, SHI Jingzhen1*( 1 The Basic Medical Laboratory of Experimental Center, Guiyang Tradit
28、ional Chinese Medicine College, Guizhou, Guiyang, 550002, China. 2 Department of Phamacology, Zunyi Medical College, Guizhou, Zunyi, 563000, China)Abstract: Objective To study the acute toxicity of cinnabar、Zhusha Anshenwan、mercuric chloride and mercurous chloride in mouse Methods Mouse were orally
29、given Zhusha Anshenwan(10、20 gkg- 1)，Cinnabar (0.3、16 gkg- 1), Mercuric Chloride (70 mgkg- 1) and Mercurous Chloride (61.2 mgkg- 1), and toxicity were assayed 8 hours later. Results Compared with the normal group， the renal injury occurred in Mercuric Chloride group; The accumulation of mercury in M
30、ercuric Chloride group was much higher than other groups; Mercuric Chloride and the high dose of Cinnabar can cause liver and kidney pathological changes, The RT-PCR analysis indicated that the expression of MT-1 and MT-2 increased in Mercuric Chloride groups and the high dose of Cinnabar, In Zhusha
31、 Anshenwan ,low dose of cinnabar and mercurous chloride groups, tissue Hg accumulation was insignificant and No MT induction was abserved. Conclusion Acute toxicity of Cinnabar and Zhusha Anshenwan at clinical dosages is much lower than that of Mercuric Chloride.Key Words: cinnabar; zhusha anshenwan; mercuric chloride; mercurous chloride; toxicity第一作者：姓名：何海洋性别：男出生年月：1982 年 3 月 25 日籍贯：河南省职称：无学位：在读研究生主要研究方向：中药药理、毒理学联系电话：15185018150邮箱：姓名：时京珍性别：女出生年月：1954 年 12 月 25 日籍贯：贵州省职称：教授学位：学士主要研究方向：中药药理、毒理学联系电话：13985134840基金项目：贵州省国际科技合作重点项目编号：黔科合外 G 字（2008）700107
